回流法提取栾树果皮中总黄酮的正交实验研究

袁 琦，蒲晓辉，詹慕欧洋，李 哲，竟香艳，陈毛芬，周云丰，崔丽丽

（河南大学 药学院，河南 开封 475004）

栾树属（Koereuteria）是无患子科落叶乔木。中国产有三个种，一个变种，分别为栾树（K.henryi）、台湾栾树（K.paniculata）、复羽叶栾树（K.bipinnata），变种为全缘叶栾树（K.bipinnata var.integrifoliola）。我们主要研究回流提取方法对栾树黄酮提取的最佳条件，为更好地利用栾树资源提供依据［1－7］。

1 材料和仪器

1.1 材料

栾树果壳于2012年3 月采自河南大学金明校区，自然风干，粉碎，装袋备用。

1.2 仪器与药品

紫外可见分光光度计UV－1600（北京瑞丽有限公司）；SHB－III循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；乙醇，硝酸铝，亚硝酸钠，氢氧化钠，三氯化铝均为分析纯。

2 实验方法

2.1 对照品溶液的配制

称取芦丁对照品0.01051g，用体积分数70%乙醇定容于50mL容量瓶中，配制成为0.2102g／L芦丁乙醇溶液，作为对照品溶液。

2.2 栾树黄酮类化合物的提取

分别准确称取已粉碎的栾树果皮10.0g，置磨口锥形瓶中，加入一定量不同浓度的乙醇为提取剂。在不同温度、时间、料液比等条件下回流提取，确定正交实验提取因素的数值。在此基础上，设计正交法进一步确定提取的最佳条件。

2.3 供试品溶液的制备以及含量测定

栾树果皮提取液过滤后的滤液，用相应浓度的乙醇定容于500mL容量瓶。吸取1mL置10mL容量瓶中，加50g／L NaNO2溶液0.3mL，振荡摇匀，放置6min 后，加100g／L Al（NO3）3溶液0.3mL，振荡摇匀，放置6min 后，再加40g／L NaOH 溶液4mL，振荡摇匀，用体积分数为30%乙醇定容至刻度，振荡摇匀，放置1.5h 后，于510nm 测量吸光度［8－9］。

2.4 标准曲线的制备

精密称取0.01051g芦丁，用体积分数为70%乙醇溶解后，定容于50 mL 容量瓶中，得0.2102g／L 芦丁的标准溶液。精密吸取芦丁对照液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL 分别置10mL 容量瓶中，按照“2.3”项下制备方法制备溶液，放置1.5h后，采用紫外分光光度法，在510nm 处测定吸光度。以对照品浓度（g／L）为横坐标，吸光度为纵坐标，求得回归方程：Y＝0.1159 X－0.00914（r＝0.9997），线性范围（1.051～7.357）×10－2g／L。

2.5 精密度实验

精密吸取芦丁标准品溶液5mL 置10mL 容量瓶中，加入体积分数为30%乙醇定容。从中吸取3mL 置10mL 容量瓶中，按照“2.3”项下配制溶液后，测其吸光度，重复测定5次，测定结果的RSD为0.19%，说明采用该方法测量黄酮含量时仪器误差较小。

2.6 重复性实验

分别精密称取栾树果皮10.0g，称取5 份，按“2.2”项下制备待测液，从中吸取1mL，按“2.3”项下配制溶液，在510nm 处测吸光度，重复测量3次，结果的RSD为0.665%，说明方法的重复性较好。

3 结果与分析

3.1 提取条件的确定

3.1.1 提取剂浓度的选择 黄酮类化合物无论是游离的黄酮苷元还是黄酮苷都易溶于甲醇、乙醇、丙酮，根据溶剂的市场价格以及毒性，采用乙醇进行提取。在提取温度80℃、时间2h的条件下，采用不同浓度的乙醇溶剂进行提取。按“2.3”项下方法测定提取液的吸光度，其结果见表1。

由表1可以看出，乙醇浓度在体积分数为50%以下时，提取率随着浓度的增大而增大，当乙醇的浓度在体积分数为50%时，效果最好。但是，随着浓度增加，提取率反而降低，主要是因为乙醇浓度不同，极性也不同。随着乙醇浓度的升高，一些脂溶性物质的溶出增加，影响了黄酮类物质的浸出。而体积分数为50%的乙醇极性与黄酮类物质的极性相似，所以提取率最高。

3.1.2 提取时间的选择 在体积分数为50%乙醇、提取温度80℃、料液比1∶15的条件下，改变提取时间，进行提取。按“2.3”项下方法测定提取液的吸光度，结果见表2。

表1 乙醇浓度实验结果数据统计

表2 回流提取时间数据统计

由表2 可知，120 min前，黄酮类物质还未充分溶出，提取率随提取时间的延长而增加，但120 min后变化不大。因为这时栾树果皮内的黄酮类物质溶出已达到平衡，延长时间只能降低效率，因此，提取时间以120min为宜。

3.1.3 料液比选择 在其他情况相同条件下，不同料液比对提取效果有一定的影响。体积分数为50%乙醇、提取温度80℃、提取时间2h、改变料液比，提取黄酮，结果见表3。

由表3可知，随着料液比的减小，提取率增加。但当料液比小于1∶25以后，随料液比的减小，提取率改变不大。从提取效果、减少溶剂用量和降低浓缩负荷等方面综合考虑，选用1∶25的料液比较合适。

3.2 正交实验设计

在以上单因素实验的基础上，确定每个因素的3个水平（见表4），因此，选用L9（33）正交表进行实验［10－11］，以栾树果皮总黄酮的提取率为考察指标。结果见表5、表6。

3.3 最佳工艺验证实验

由表7可知，测定的结果相比较于正交实验表中的最佳组合（3.223%）低0.186%，但是从节约溶剂、时间上来看，时间120 min，料液比1∶30 是比较合适的。

表3 固液比实验数据统计

表4 因素水平设计

表5 L9（33）正交实验表

表6 方差分析表（%）

表7 最佳工艺的验证实验（%）

3.4 实验结论

比较表6中R的大小，可知RB最大，故因素B对实验结果影响最大，其次是A和C。比较各个因素不同水平的综合平均值，可知最优条件是A3B3C1，RA、RC比较小，因此因素A、C 对结果影响不大。考虑到成本问题，可以选择体积分数为40%的乙醇进行提取，回流时间120 min。因此最佳方案为A2B3C3，即体积分数为40%乙醇、时间120min、料液比1∶30。

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