沙鼠前脑缺血再灌注损伤后脑组织HSP27和IGF－1的表达变化

程 坤，胡治平

脑功能在缺血再灌注（I／R）后出现严重的障碍，称之为脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤是多种因素相互作用的结果［1］，其机制可能包括：自由基生成增多、内皮细胞黏附分子的表达、细胞内钙离子超载、前列腺素增高、蛋白酶的激活、细胞因子产生增加和兴奋性氨基酸释放过度等诸因素。近些年来，关于小热休克蛋白（small heat shock protein，sHSP）和胰岛素样生长因子－1（insulin－like growth factor，IGF－1）与脑缺血性损伤的研究日益受到关注。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型建立 将北京动物实验研究中心提供的健康雄性蒙古沙鼠（体重90g±10g），随机分为正常对照组、假手术组、I／R6h组、I／R1d组、I／R3d组、I／R7d组。对于I／R组用戊巴比妥（30mg／kg）腹腔麻醉后，迅速分离并暴露双侧的颈总动脉，夹闭10min后恢复血流，然后按照分组于6h、1d、3 d、7d后断头处死动物。

1.2 主要试剂 北京中杉金桥生物技术有限公司提供的HSP27和IGF－1兔多克隆抗体，SP免疫组织化学试剂盒以及DAB显色试剂盒。

1.3 病理变化、免疫组织化学染色法的观察 行常规HE染色，用光学显微镜观察海马CA1区的病理变化。采用免疫组织化学SP法检测脑组织中HSP27、IGF－1的表达，阳性为细胞质见棕褐色细颗粒。

1.4 统计学处理 实验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用LSD－t检验法、直线相关分析法；统计分析使用SPSS Ver.15.0软件完成。

2 结 果

2.1 病理观察结果 随再灌注时间延长可见胶质细胞和细胞间质水肿、肥大、增生，神经元坏死，以缺血再灌注3d、7d组损伤较重。

2.2 免疫组化结果 阳性为细胞质见棕褐色细颗粒，在正常对照组及假手术组差异无统计学意义（P＞0.05），两组前脑皮质神经元、神经胶质细胞中HSP 2 7和IGF－1有少量表达。在I／R6h组HSP27和IGF－1的表达开始增加，与假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；I／R3d组呈强阳性反应，表达达到高峰；与假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；I／R7d组表达虽较前减少，但仍高于假手术组（P＜0.05）。I／R各组间表达差异有统计学意义（P＜0.05）。在相同诱发条件下，HSP27和IGF－1在前脑皮质神经元、神经胶质细胞中的表达一致，直线相关分析表明表达呈正相关（r＝0.848，P＜0.05）。详见表1。

表1 各组Hsp 27和IGF－1阳性细胞数表达（x±s）

3 讨 论

HSP27是在哺乳动物中发现的分子量为27kD的小热休克蛋白。在生理情况下HSP27主要以组成型即非磷酸化形式在脑干和脊髓细胞胞浆中表达，脑皮质细胞中有少量表达［2］。HSP27在神经细胞处于缺血缺氧状态、癫痫发作、过高体温等应激状况时被诱导，在丝氨酸位点上磷酸化，形成磷酸化的异构体，在脑皮质细胞中表达增加，从而发挥其分子伴侣细胞保护作用。

Kazuhiko等［3］研究表明缺血再灌注1，HSP27在沙鼠海马齿状回的表达开始增加，至2d～4d达到高峰；而如果夹闭时间延长至6分～8.5分，则还可见CAI区表达HSP27。本实验与上述的实验结果相似。可能的原因是：一些有害细胞因子在缺血再灌注后其表达开始上调，从而激活转录因子HSF，与HSE结合并启动HSP27的基因，从而使磷酸化的HSP27表达上调［4］，并发挥其分子伴侣、抑制细胞凋亡、抗炎等细胞保护作用。

IGF－1是一类广泛存在于机体多种组织中的小分子蛋白多肽，分子量约为7 500kD，IGF－1在脑组织中广泛分布。IGF－1主要以与胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）结合存在，游离IGF－1与结合IGF－1可以互相转化。IGF－1的大部分细胞效应是通过IGF－1受体实现的［5］。IGF－1在正常脑组织可促进正常生长和脑的发育。一些研究表明，IGF－1内源性水平被上调在缺血再灌注的脑组织中，从而调节内源性的修复和保护机制［6］。

Hwang等［7］观察到脑缺血早期（1 2h～2 4h）内源性IGF–1在海马、齿状回神经元和胶质细胞表达增加，且与抑制迟发性神经细胞死亡有关。在本实验得出一致的结论。IGF－1保护缺血性脑损伤的可能机制有：降低脑血管阻力、抑制神经细胞凋亡、对抗兴奋性氨基酸毒性、防止细胞的钙超载、调节一氧化氮合酶活性等［6］。此外在缺血性脑损伤中IGF－1的合成增多，还参与神经元的修复和再生。

HSP27与IGF－1在脑缺血再灌注损伤中的关系国内外尚无研究。李旺辉［8］观察到，在注入IGF－1组缺血再灌注SD大鼠，HE染色显示神经细胞坏死程度明显减轻，用免疫组化显示其脑组织HSP70表达明显增加。推测IGF－1在脑缺血再灌注损伤中通过增加HSP70蛋白的表达而起保护作用。余国伟等［9］的实验表明在低温保存液中添加IGF－1可明显降低心肌细胞凋亡的发生，促进再灌注期心功能的恢复。IGF－1的心肌保护机制可能与HSP90依赖性Akt激活和线粒体转位有关。Shan等［10］观察到，HSP60在缺血再灌注的心肌细胞中的表达增加，HSP60可能抑制IGF－1的降解，增大其抗凋亡的作用。

本实验观察到HSP27和IGF－1在相同诱发条件下，其表达具有空间定位一致、时间变化趋势相似的特点。表明在沙鼠脑缺血再灌注损伤中HSP27与IGF－1发挥相互协同脑保护作用。作用包括两方面：一则在缺血再灌注时机体产生应答，从而HSP27表达增加，利用其分子伴侣功能，帮助IGF－1折叠及移位，防止其聚集，抑制其降解，还可以帮助变性的IGF－1解聚及复性，从而发挥细胞保护作用；另则在缺血再灌注后IGF－1可上调HSP27在脑组织中的表达，机制可能为p38MAPK是MAPKs信号转导通路的重要成员，诱导磷酸化HSP27表达的上游信号通路来促进其细胞保护作用［11］，又脑缺血后IGF－1表达增加，可激活MAPKs信号转导通路，因而HSP27磷酸化后被激活，由胞质迅速移入细胞核而发挥作用。IGF－1能防止脑缺血再灌注中细胞内钙超载，减轻了对HSP27表达的抑制。

在脑缺血再灌注损伤中HSP27和IGF－1对脑组织起重要的保护作用，是否可以利用 HSP27和IGF－1上述作用以及IGF－1促进血管和神经再生的作用，研制并开发药物，将有巨大的临床价值。

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