兔BBMSCs体外培养及其与水凝胶复合体的制备

江仲超

吉林大学中日联谊医院骨科，吉林长春 130021

将与治疗有关的细胞、干细胞接种于特定性能的三维生物支架材料上增殖培养后移植到体内受损组织处来修复受损的组织[1]，这就是组织工程。原位成胶塑型随意、操作简单、创伤小是可注射水凝胶的优点，因此受到人们的关注。生物相容性良好，无免疫原性和可生物降解吸收等优良性能是水凝胶生物支架被广泛应用于基础生物医学与临床领域[2]的原因。研究表明物理水凝胶可制成一种可注射性支架，在室温下为液态，注射到体内时会变为凝胶。本实验将制备骨髓基质干细胞与水凝胶复合体，并检测细胞存活情况及其生物相溶性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂DMEM 培养基；胎牛血清、胰蛋白酶；MTT试剂，DMSO试剂。

1.1.2仪器倒置相差显微镜（Olympus）、CO2孵箱（BB16UV）、台式高速离心机[T GL-16G（B）]、超净工作台，DG5031型酶联免疫检测仪。

1.1.3动物日本大耳白兔(吉林大学实验动物中心)。

1.2 方法

1.2.1兔BMSCs的体外分离培养取3周日本大耳白兔，雌雄不拘。耳缘静脉空气栓塞处死后置于75%酒精浸泡约5~10 min，无菌条件下取股骨、胫骨，注射器吸取20 mL PBS冲洗髓腔两遍，冲洗液离心弃掉含有脂肪的液体，达到初步纯化，后用培养液吹散细胞，制成细胞悬液接种于塑料培养瓶中，饱和湿度37℃在5%CO2恒温培养箱培养，72 h后半量换液，将未贴壁的细胞全部弃掉，以后每周换液2次。细胞基本铺满培养瓶底壁时，胰酶消化，10%胎牛血清L-DMEM终止消化，离心制成悬液，105/mL传代。

1.2.2 PLGA-PEG水凝胶的制备每个青霉素小瓶中称取PLGAPEG粉末0.5 g，密封好紫外灯照射灭菌20 min于超净台中在每小瓶材料中加入培养液1.5 mL密封后置于4℃冰箱保存。

1.2.3 BBMSCs与水凝胶复合物制备取生长良好的第三代BBMSCs进行消化，1500 rpm离心10 min，细胞沉淀，以1 mL培养液重悬细胞进行细胞计数细胞数约为106个，在5 mL离心管中加入水凝胶溶液0.5 mL，细胞悬液0.5 mL，充分混匀，密封离心管，置于4℃冰箱中保存。

1.2.4水凝胶的细胞相容性研究取生长良好的第三代BBMSCs，调节细胞的浓度, 使得细胞的个数为104个，将细胞接种到96孔板中。设置空白对照及阳性对照孔，放入培养箱中孵育24 h至细胞贴壁。实验孔中加入180 μlPLGA-PEG溶液，浓度依次成倍递减，然后放入培养箱中继续孵育24 h。实验孔每孔加入 MTT溶液20 μl，后继续培养4 h；4 h后将孔中液体弃掉，每也加入200 μl DMSO，酶联免疫检测仪测量492 nm处细胞的 OD值。

2 结果

2.1 细胞形态的观察

骨髓基质干细胞的培养瓶中细胞在倒置相差显微镜下观察多数为圆形。少数细胞在原代BMSCs培养4 h后即有贴壁生长，7天后全量换液可见细胞呈多角形、或长梭形散布于瓶底。下图为原代细胞生长曲线（图1）。

图1 原代细胞生长曲线

2.2 水凝胶成胶时间

图2 PLGA-PEG相图

应用试管倒置法测水凝胶成胶温度，配制不同浓度的PLGA-PEG溶液，置于恒温水浴中，从5℃开始，每10 min升高1℃，倒置试管30 s不流动定义为成胶，测得成胶温度30℃。下图为 PLGAPEG相图（图2）。

2.3 水凝胶的生物相溶性

应用MTT试验测定PLGA-PEG水凝胶的生物相溶性。将注有骨髓基质干细胞悬液而没有加PLGA-PEG水凝胶的孔做为空白对照。将注有骨髓基质干细胞悬液加PEI水凝胶的孔做为阳性对照。骨髓基质干细胞的活性随着PLGA-PEG的浓度增加而逐渐减低；阳性对照组也显示出相似的趋势，但是PLGA-PEG组细胞活性要高于阳性对照组。可知，PLGA-PEG水凝胶具有较低的细胞毒性，具有良好的生物相溶性。

3 讨论

作为一群存在于骨髓中的非造血干细胞，骨髓基质干细胞（bone marrow stem cell，BMSC）目前已成为应用较广泛的重要种子细胞之一[4]。因其具有较强的自我更新能力、多向分化潜能和可塑性能、细胞[3]BMSC取材方便、在体外培养体系中具有较强的增殖传代能力，免疫活性低的诸多优点。骨髓中BMSC的含量约占骨髓有核细胞的1/10万，含量极低，难以满足细胞工程的需求[5]。所以要应用其中的BMSC，就必须将它从造血系细胞中分离出来。因此,要进一步开展BMSC应用研究的实验首先必须建立体外分离、纯化和大量扩增BMSC的方法，探索保持其增殖潜能的适宜培养条件。

室温下为液态、体温下成胶是PLGA-PEG水凝胶的独特性质，且与以往的 含有PEG水凝胶相比，具有更小的细胞毒性、更加良好的细胞相容性[6]。BMSCs在PLGA-PEG水凝胶表面生长的形态良好，数量多。通过MTT试验可见PLGA-PEG水凝胶具有良好的生物相容性。BMSCs能够在水凝胶的内部伸展和生长，可模拟生物体内细胞外基质环境，为细胞提供支持和固定等作用。本研究构建出的PLGA-PEG水凝胶可为细胞提供支持和固定，还可以调节细胞间的沟通等作用。结构及功能也与细胞外基质相似，作组织工程用生物支架材料十分理想。

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