离子交换分离混合氨基酸实验方法的改进

黄 毅，袁小红

(西南科技大学 生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010)

离子交换层析分离混合氨基酸是生物化学或生物制药工艺学实验课程中一个重要的制备实验。从20世纪80年代至今，国内高校相关专业基本沿用两套教学体系:第一套以柠檬酸－氢氧化钠－盐酸缓冲溶液(控制pH和钠离子浓度)进行样品上样，并以相同溶液进行后续氨基酸洗脱［1－2］;第二套体系采用柠檬酸缓冲溶液作为平衡液进行树脂平衡及上样，而后用氢氧化钠溶液作为洗脱液进行氨基酸样品洗脱［3］。两套体系均使用强阳离子交换树脂(如732树脂)。通常用来分离的氨基酸包括赖氨酸、天冬氨酸、组氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸等。第一套方案简单快捷，但单一缓冲液上样洗脱模式并未将离子交换技术的常规操作步骤融入到实验中，其原理及实验操作对该技术展现不完全，学生在学习过程中所获知识较少;第二套体系展示了离子交换技术的基本原理并展现了改变pH进行样品洗脱这一常规离子交换分离方案，是较好的教学实验体系，国内很多院校多采用此方案。经多年使用，该方案虽然有所衍化提高，但笔者在这几年的授课中发现实验过程中仍然存在诸多问题，比如实验结果不稳定、结果解释不清晰、学生疑问较多及课程设置存缺陷等问题。通过重新设计实验教学授课方案并修改指导手册，解决了以上问题，提高了教学效果，现与同行分享，希望批评指正。

1 现有实验方案问题

该实验一般采用苯乙烯性磺酸钠型阳离子交换树脂(001×7，732型)作为分离介质，分离的目标混合氨基酸包括酸性氨基酸天冬氨酸(Asp，p I=2.97)，碱性氨基酸赖氨酸(Lys，p I=9.74)以及中性氨基酸丙氨酸(Ala，pI=6.02)等。为简便实验过程，常选择前两个氨基酸混合组成目标分离溶液。实验中使用0.5 mol/L，pH=4.5～5.5的柠檬酸缓冲溶液作为平衡液平衡柱子，在样品上样后，继续以该平衡液冲洗柱子从而以穿透峰形式洗脱出第一个氨基酸Asp。实验原理是利用4.5～5.5的环境pH低于Lys的pI值，Lys解离成阳离子形式与树脂的平衡离子发生交换而结合于柱上，而Asp解离成阴离子，不被吸附从而穿透流出层析柱。通过茚三酮反应检查第一个氨基酸穿透洗脱后，立刻改用pH约为11～13左右的氢氧化钠溶液作为洗脱液冲洗柱子，此时柱中pH环境逐步升高并高于Lys的pI，其解离成阴离子状态从而无法与树脂结合而被洗脱下来。这样，通过以上两步操作就将混合氨基酸分离。虽然有部分作者修订了该方法的部分问题［4］，但实验中仍可能会遇到如下问题:

1.1 茚三酮反应结果不稳定

因氨基酸无色，要检查实验结果必须用氨基酸茚三酮显色反应。国内权威生物化学教材已讲明茚三酮在弱酸性溶液中与α－氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧，最后茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮发生作用，生成紫色物质［5］。根据以上理论，茚三酮反应必须保证在偏酸性环境下进行，所以很多实验教材中都说明在进行该检测时需在反应体系里面加入少量醋酸或其他缓冲溶液以控制pH值［6］，特别是洗脱第二个氨基酸时所用洗脱液为氢氧化钠溶液，就更需要将茚三酮反应体系调到偏酸性，不然反应的结果不会出现紫色，只会出现淡黄色［7］。而且pH对体系的影响其实不光是显色，还包括显色时间等［8］，由于学生个体在实验中加酸或缓冲溶液及加热反应时间的差异，会造成反应结果出现一定偏差，无法较好地进行教学和讨论。

1.2 两个洗脱的氨基酸无法分辨

虽然穿透洗脱和后面的加碱洗脱将两个氨基酸都分别洗脱分离，但由于显色体系一样，结果都呈现蓝紫色，无法表观分辨到底是哪个氨基酸先洗出哪个后洗出，授课时只能根据理论解释第一个是Asp，第二个是Lys。如要证明，必须补加纸层析等其他实验。显然这对部分求知欲较强的学生来说，该实验是不完善的。

1.3 教学设计存在一定缺陷

该实验主要是让学生掌握离子交换技术的基本理论及实验操作。理论教学中已经说明离子交换树脂分离化合物是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异来进行物质分离的。分离方式包括两种:一种是通过改变pH值从而改变两性电解质带电荷状况，以完成样品与色谱柱的吸附和解析;另一种是利用质量作用定律采用其他高强度离子进行取代分离［9］。以上实验只应用了第一种分离方式，实际上第二种方式在离子交换技术中的应用更广泛、更深入。这样的实验设计缺陷会使学生学习结束后形成离子交换分离主要依靠pH值控制这一狭隘认识。

2 解决办法

为解决以上问题，笔者通过文献检索及多次实验研究，对实验方法进行了如下改进:

1)将常用的强阳离子交换树脂更换为苯乙烯性季铵型阴离子交换树脂(201×7，717型)。该树脂和原732树脂价格基本无差异，因此不影响实验预算;

2)在树脂用酸碱处理结束并改型后直接置于蒸馏水中浸泡备用。学生装柱时直接用蒸馏水浸泡的树脂装柱，装柱结束后无需用柠檬酸缓冲液平衡就可进行样品上样，然后直接用蒸馏水洗脱，可得到穿透洗脱的Lys;

3)第一个氨基酸穿透洗脱后，用pH=4.5～5.5的柠檬酸缓冲溶液进行洗脱，可洗脱第二个氨基酸Asp。

该方案的设计原理是利用蒸馏水pH为中性，在中性环境下Lys带正电荷，不能和阴离子树脂上的平衡离子交换，无法结合于柱上，直接穿透洗脱;而后在pH=4.5～5.5的柠檬酸缓冲溶液环境下，虽然Asp仍然带负电荷，但柠檬酸根是离子强度较强的阴离子，可以利用质量作用定律将Asp置换下来。

3 新方案优点

1)因树脂直接在蒸馏水中浸泡，装柱及穿透洗脱均用蒸馏水，去掉了原有缓冲液平衡一步，减少了前期实验准备及实验过程时间。

2)两次洗脱氨基酸的环境分别处于中性(蒸馏水)和偏酸性环境(pH=4.5～5.5柠檬酸缓冲溶液)，因此进行茚三酮显色反应时不再需要添加乙酸或醋酸缓冲溶液等pH调节试剂，这样就减少了学生实验中添加酸性缓冲溶液的个体误差。

3)洗脱氨基酸便于分辨。由于Lys在中性环境下的茚三酮反应为紫红色，Asp在偏酸性环境下的茚三酮反应为蓝紫色，对照文献，学生可明确知道第一个洗脱的是Lys，第二个洗脱的是Asp［10］。

4)授课过程中，学生除了知道了pH值调整是离子交换技术一个重要技术手段外，更清楚质量作用定律下离子强度的重要。实验过程中学生带着“为什么Asp带负电荷依然能从阴离子交换树脂上被洗脱”的问题进行，增加了思考，全面掌握了离子交换技术的两种常用洗脱方法。

4 结束语

在改进后的实验中实验器材、上样量等均无更改，只是更换了树脂、平衡溶液和洗脱液，减少了平衡液平衡过程及NaOH洗脱液配置。这不只是减少了老师前期准备工作量、时间、学生实验时间及部分实验经费，还优化了实验的设计，使学生实验做得畅快，理论学得更扎实。另外可在实验课程中分组同时运用新旧两种方法，使学生体会到书本上的实验条件、实验方法并非是固化的，可以根据所掌握的实验技术和理论知识，对实验条件和实验方法进行大胆的探索与实践，从问题中来到问题中去。这样既有利于启迪学生的创新思维，又有利于培养学生解决问题的能力，为将来的实际工作打好基础。修改后的指导书还将该实验升级，将两种氨基酸混合液转换为蛋白水解物［11］，与实践结合更紧密，增加了实验难度，可作为学生创新综合性实验开出，更好地锻炼学生的动脑动手能力。实验［M］.北京:高等教育出版社，1982.

［2］董晓燕.生物化学实验［M］.2版.北京:化学工业出版社，2008.

［3］宋方州，何风田.生物化学与分子生物学实验［M］.北京:科学出版社，2008.

［4］张红梅，盂新云，官守涛.氨基酸离子交换色谱实验方法改进［J］.郧阳医学院学报，2006，25(1):42.

［5］王镜岩.生物化学［M］.3版.北京:高等教育出版社，2000.

［6］陈忠云.α－氨基酸和茚三酮显色反应机理［J］.教材通讯，1991(2):36－37.

［7］陆珊华，孙爱民.离子交换树脂层析分离混合氨基酸［J］.南京医学院学报，1989，9(4):307.

［8］张振华.α－氨基酸与茚三酮显色反应影响因素的探讨［J］.邵阳高等专科学校学报，2000，13(1):42－44.

［9］吴梧桐，高向东.生物制药工艺学［M］.2版.南京:中国医药科技出版社，2004.

［10］张鉴棠，汤秀玉，韩红.不同PH对氨基酸与茚三酮呈色反应的影响［J］.南京铁道医学院学报，1992，11(2):126－128.

［11］胡琼英，狄洌，聂理，等.生物化学实验［M］.北京:化学工业出版社，2007.