响应面法优化微胶囊固定化粘红酵母生产L-苯丙氨酸的工艺条件

周 林,罗世翊

(1.上海科元燃化工程设计有限公司,上海200235; 2.厦门大学化学工程与生物工程系,福建厦门361005)

响应面法优化微胶囊固定化粘红酵母生产L-苯丙氨酸的工艺条件

周 林1,罗世翊2

(1.上海科元燃化工程设计有限公司,上海200235; 2.厦门大学化学工程与生物工程系,福建厦门361005)

以微胶囊固定化粘红酵母为研究对象,考察了粘红酵母转化反式肉桂酸(t-CA)生成L-苯丙氨酸过程中转化体系温度、p H值、cNH+4/ct-CA对L-苯丙氨酸积累量的影响,并通过响应面法对转化条件进行了优化,得到最佳转化条件为:温度30.75℃、p H值11.58、cNH+4=4.77 mol·L-1、ct-CA=10 g·L-1,在该条件下,L-苯丙氨酸积累量为27.5 g· L-1。

微胶囊;粘红酵母;L-苯丙氨酸;响应面法;优化

L-苯丙氨酸(L-Phe)是具有生理活性的芳香族氨基酸,是人和动物必需的氨基酸之一。近年来,L-Phe在医药领域的应用越来越被人们所重视,需求量增长了近30%,未来几年对高纯度L-Phe的需求可能还会有爆发性的增长。

L-Phe的生产方法主要是发酵法,基于先进的基因工程育种及膜分离技术,利用糖质原料直接发酵生产[1]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)逆向催化法生产LPhe,工艺路线简单、杂酸量低、产物回收率高,可以满足医药行业对高纯度L-Phe的需求,不足之处在于PAL游离细胞处在高p H值、高NH+4浓度、高离子强度的反应体系中容易失活[2]。如何提高PAL在反应体系中的活性是该法生产L-Phe的关键[3,4]。

作者在液芯CMC-ALG微胶囊固定粘红酵母取得不错效果的基础上,对微胶囊固定化粘红酵母发酵生产L-Phe的工艺条件进行优化,旨在为后续研究奠定基础。

1 实验

1.1 菌种

粘红酵母NC07。由作者在原诱变得到的粘红酵母NC06的基础上进一步进行γ-诱变、亚硝基胍诱变后,筛选得到。

1.2 培养基

斜面培养基(g·L-1):蛋白胨10,酵母粉10,葡萄糖10,NaCl 2,琼脂15,KH2PO42,MgSO40.2,p H值6.5。

诱导培养基(g·L-1):蛋白胨10,酵母粉10, NaCl 5,琼脂15,L-Phe 5,p H值6.0。

诱导液体培养基(g·L-1):蛋白胨10,酵母粉10,NaCl 5,L-Phe 5,p H值6.0。

基础底物转化液(g·L-1):(NH4)2SO4200,t-CA 10,CaCl22.5,蒸馏水。

1.3 方法

1.3.1 细胞增殖培养及微胶囊固定化

参照文献[5,6]方法进行。

1.3.2 固定化细胞制备L-Phe

在25℃、p H值为10的条件下进行酶促转化反应。向50 m L三角瓶中加入基础底物转化液20 m L,充N2,160 r·min-1下振荡反应6 h[7-9];然后向三角瓶中添加60 mg反式肉桂酸(t-CA)粉末,充N2,160 r ·min-1下振荡反应6 h;反应结束后,再添加60 mg t-CA粉末,充N2,160 r·min-1下振荡反应6 h,如此重复共进行10批次反应。反应结束后,离心收集转化液,测L-Phe含量。

1.3.3 L-Phe含量TLC检测

取转化液上清液以GF254硅胶薄层板(厚度0.20～0.25 mm)进行点样分析。展开剂为正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1),Rf=0.52,展距15 cm,展开6～7 h后,层析板在通风橱自然挥干溶剂后喷雾茚三酮溶液,放入105℃烘箱中显色10 min。根据显色板上斑点面积由标准曲线推算样品中L-Phe含量。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 温度对L-Phe积累量的影响

在其它条件不变的情况下,考察温度对转化反应的影响,结果如图1所示。

图1 温度对L-Phe积累量的影响Fig.1 Effect of temperature on L-Phe yield

由图1可知,温度从室温20℃逐渐升高时,L-Phe积累量明显升高;升至30℃时,L-Phe积累量达到最大;之后随着温度的升高,L-Phe积累量逐渐下降。这是由于温度过高导致转化反应关键酶PAL失活,使得肉桂酸转化生成L-Phe的速率逐渐降低。

2.1.2 p H值对L-Phe积累量的影响

在其它条件不变的情况下,考察p H值对转化反应的影响,结果如图2所示。

图2 p H值对L-Phe积累量的影响Fig.2 Effect of p H value on L-Phe yield

由图2可知,当p H值由9.0逐渐增大时,L-Phe积累量相应升高;当p H值增大至11.0时,L-Phe积累量达到最大;当p H值增大至11.5,L-Phe积累量急剧下降。这说明适当的碱性环境有利于PAL催化反应逆向进行,但是过高的p H值容易导致PAL失活,即使细胞处在微胶囊的体系中也不能承受外界过高的碱性。

根据前期实验及文献经验,转化液中t-CA的浓度不能过高,过高会存在底物抑制效应,不利于L-Phe的生成和积累,最适的t-CA浓度在10 g·L-1左右[8,9]。因此,本实验中将t-CA浓度固定为10 g· L-1,在其它条件不变的情况下,改变的浓度,考察转化反应中不同底物浓度比对转化反应的影响,结果如图3所示。

图3 NH+4浓度对L-Phe积累量的影响Fig.1 Effect ofconcentration on L-Phe yield

2.2 响应面优化工艺条件

2.2.1 中心组合实验设计

根据中心组合实验设计原理,在单因素实验的基础上,选取转化体系温度(X1)、p H值(X2)、(X3)为自变量,以L-Phe的积累量(Y)为响应值,进行优化实验,实验因素与水平如表1所示,实验设计与结果如表2所示。

表1 中心组合实验因素与水平Tab.1 Factors and levels of the centre composition experiment

2.2.2 回归模型分析

利用Design Expert 7.0对表2数据进行二次多元回归拟合,得到L-Phe积累量(Y)对自变量转化体系温度(X1)、p H值(X2)(X3)的二次多元回归方程:

表2 中心组合实验设计与结果Tab.2 Design and results of the centre composition experiment

根据回归方程预测出的L-Phe积累量见表2。

由表2可知,预测值和实验值比较接近,复相关系数R2=0.9293,表明近92.93%的实验数据可以用该模型来表征。

对回归方程进行方差分析,结果见表3。

表3 回归方程方差分析Tab.3 Variance analysis of the regression equation

2.2.3 最佳转化条件的确定

针对上述模型,利用Design Expert 7.0绘制出等高线图,如图4所示。

图4 各因素对L-Phe积累量影响的等高线图Fig 4 Contours of effects of the factors on L-Phe yield

由图4可知,PAL催化反式肉桂酸生成L-Phe反应中,转化体系温度、p H值和浓度之间存在着一定的相互制约,它们共同影响着L-Phe的积累过程,温度、p H值及浓度过低或者过高均不利于催化反应的进行。

同时对回归方程求偏导数,得到最佳条件点:

X1=0.15(T=30.75℃)、X2=1.16(p H=11.58)、X3= 0.54(=4.77 mol·L-1)

在最佳工艺条件下,对微胶囊固定化粘红酵母催化反式肉桂酸生成L-Phe过程进行了10批次验证实验,得到L-Phe最大积累量为27.5 g·L-1,与模型理论值基本相符。

3 结论

在单因素实验的基础上,采用响应面法对微胶囊固定化粘红酵母转化反式肉桂酸生成L-Phe的转化条件进行了优化,得出最佳转化条件为:温度30.75℃、p H值11.58、=4.77 mol·L-1=10 g· L-1。在此条件下,L-Phe最大积累量为27.5 g· L-1,与模型理论值基本相符。说明所拟合模型合理、可靠,对于粘红酵母NC07全细胞催化反式肉桂酸合成L-Phe的下一步发酵罐规模试验有一定的指导意义。

[1] 李正西.L-Phe的生产及市场分析[J].精细石油化工进展,2000, 11(12):47-49.

[2] 邓旭,卢英华,李清彪.固定化细胞合成L-Phe的酶活及稳定性[J].厦门大学学报,1997,36(3):430-435.

[3] 杨敏,杨顺楷.化学诱变结合结构类似物法选育高苯丙氨酸解氨酶菌种[J].应用与环境生物学报,1999,5(5):541-546.

[4] 李清彪.增加PAL活力稳定性的方法[A].第七届全国化学工程论文报告会论文集[C].北京,1994:331-334.

[5] 柴燚,梅乐和,姚善泾.液芯CMC-ALG微胶囊的制备、扩散性能及初步应用研究[J].膜科学与技术,2004,24(3):10-14.

[6] 罗世翊,林丽芹,卢英华.液芯CMC-ALG微胶囊固定化生产L-苯丙氨酸[A].第三届全国化学工程与生物化工年会论文集(上) [C].2006.

[7] 张惠勇,姚善泾.微胶囊固定化酵母培养的研究[J].生物工程学报,1999,15(3):297-300.

[8] Yamada S,Nabe K,Izeo N,et al.Production of L-phenylalanine from trans-cinnamic acid with Rhodotorula glutinis containing L-phenylalanine ammonia-lyase activity[J].Appl Environ Microbiol,1981,42(5):773-778.

[9] 赵玉星.利用粘红酵母转化反式肉桂酸生成L-苯丙氨酸的研究[D].天津:天津轻工业学院,2000.

Optimization of Conditions for Producing L-Phenylalanine by Rhodotorula Glutinis Immobilized in Microcapsule Using Response Surface Methodology

ZHOU Lin1,LUO Shi-yi2
(1.Shanghai Keyuan Chemical&Gas Engineering Design Co.,Ltd.,Shanghai 200235,China; 2.Department of Chemical and Biochemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,China)

Taking Rhodotorula glutinis immobilized in microcapsule as the research object,the effects of temperature,p H value,concentration and t-CA concentration on L-Phe yield using t-CA as substrate by Rhodotorula glutinis were investigated.The parameters of reaction were optimized by response surface methodology.The optimum conditions were obtained as follows:temperature was 30.75℃,p H value was 11.58,concentration was 4.77 mol·L-1,t-CA concentration was 10 g·L-1.The maximal L-Phe yield was 27.5 g· L-1under the optimum conditions.

microcapsule;Rhodotorula glutinis;L-Phe;response surface methodology(RSM);optimization

TQ 922.2

A

1672-5425(2013)05-0057-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.05.016

2013-03-06

周林(1980-),男,江苏扬州人,工程师,主要从事生物化工工艺设计及产业化研究,E-mail:zhoulin@kyedc.cn。