锌影响坐骨神经损伤模型小鼠脊髓P物质表达的实验研究

张 莉，刘 明，王月静

辽宁医学院 组织学与胚胎学教研室，辽宁锦州 121001

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是继发于中枢或者外周神经系统损伤之后的慢性疾病状态，原因包括感染、外伤、肿瘤等，主要表现是痛觉过敏、痛觉超敏、感觉缺失及自发疼痛等，严重影响患者的生存质量[1-2]。研究发现，外周神经损伤后，脊髓P物质(substance P，SP)表达增高，从而加重NPP的症状[3]；而微量元素锌能提高NPP动物的痛阈，减轻痛觉过敏现象，因此，为深入研究锌对NPP的影响，我们应用坐骨神经分支选择性损伤(sciatic nerve injure，SNI)手术制备NPP动物模型，利用原子吸收光谱技术、免疫组织化学技术、免疫印迹技术和图像分析技术研究锌对NPP模型动物脊髓P物质(substance P，SP)的影响，从而为研究锌参与NPP的可能机制提供基础的实验依据。

材料和方法

1 动物分组与模型制备 48只CD1小鼠随机分为4组：1)对照组(Con)：正常动物接受假手术；2)适锌喂养神经分支损伤(N-NPP)：适锌饲料[锌：30.0 mg/(kg·d)]喂养2周后接受SNI手术；3)低锌喂养神经分支损伤(L-NPP) ：低锌喂养[锌：0.85 mg/(kg·d)]2周后接受SNI；4)高锌喂养神经分支损伤(H-NPP)：高锌喂养[饮用硫酸锌水溶液，227 mg/(L·d)]2周后接受SNI手术。SNI手术：暴露坐骨神经主干至坐骨神经分叉，保留腓肠神经，结扎并切断腓总神经和胫神经后逐层缝合。假手术：只暴露和分离坐骨神经主干至坐骨神经分叉处，之后逐层缝合。

2 主要试剂与仪器 山羊抗小鼠多克隆SP抗体和兔抗山羊IgG多克隆抗体购自Santa公司；免疫组织化学染色试剂盒和DAB染色剂均购自福州迈新公司；GAPDH鼠单克隆抗体购自康成生物公司；ECL试剂盒和胶片购自Santa公司；PVDF膜和蛋白marker购自NEB公司；光学显微镜、原子吸收光谱仪和计算机图像分析系统等。

3 取材与标本制备 于SNI术后7d，将各组小鼠经4%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔麻醉，取小鼠血清和腰5节段脊髓，一部分放置于-20 ℃冻存，用于原子吸收光谱技术检测和免疫印迹检测；一部分经4%多聚甲醛固定12 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制备5 μm厚的石蜡切片，用于免疫组织化学染色。

4 原子吸收光谱技术检测血清和脊髓锌的含量于SNI术后7 d取血清和脊髓组织。取血清0.5 ml，加入三氯醋酸，3 000 r/min离心5 min，取上清液，加入SDS-Tris缓冲剂、显色剂和水合氯醛溶液，于波长555 nm处比色，计算血清锌含量。脊髓组织经混合酸浸泡过夜后消化，用1%硝酸溶解备用。利用原子吸收光谱分析法测定脊髓中的锌含量。

5 免疫组织化学染色检测SP在脊髓的表达 石蜡切片常规脱蜡水化，微波修复。3% H2O2孵育10 min；PBS冲洗，5 min×3次；正常非免疫动物血清孵育10 min；山羊抗小鼠多克隆SP抗体(1∶100)，4 ℃孵育过夜；PBS冲洗，5 min×3次；兔抗山羊IgG(1∶200)室温下孵育10 min；PBS冲洗，5 min×3次；链霉素抗生物素-过氧化物酶孵育10 min；PBS冲洗，5 min×3次；DAB显色5 min，苏木精复染细胞核，常规脱水、透明和封片，光镜下观察。用正常非免疫动物血清代替一抗作为阴性对照。

6 免疫印迹技术检测SP在脊髓的表达 脊髓组织称重后剪碎，加入裂解液，进行超声波粉碎，4 ℃过夜，低温离心取上清液。测蛋白浓度，沸水浴煮5 min，离心备用。制备分离胶，加样，SDSPAGE电泳，转膜，染膜，封闭，加一抗：山羊抗小鼠多克隆SP抗体(1∶500) 4 ℃孵育过夜，TBST漂洗，5 min×3次，加二抗(兔抗山羊IgG，1∶5 000)孵育2 h。TBST漂洗，5 min×3次，ECL发光，X线曝光、显影、定影，计算机图像分析。

7 图像分析SP在脊髓的表达 用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对免疫组化和免疫印迹结果进行图像分析。每个样本选取5张切片，每张切片于400倍光镜下系统随机选取3个视野进行检测，计算平均光密度值(average optical，AO)。

8 统计学处理 应用SPSS软件进行统计学处理，实验数据用-x±s表示，采用单因素方差分析(ANOVA)方法进行数据分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组锌含量比较 对照组(Con)血清锌(23.42±0.67) μmol/L，脊髓锌(7.16±0.11) mg/kg；SNI术后7 d，适锌饲料喂养的NPP小鼠血清锌(15.14±0.58) μmol/L，脊髓锌(5.23±0.21) mg/kg；高锌喂养(H-NPP)组血清锌(30.12±0.52) μmol/L，脊髓锌(10.27±0.16) mg/kg；低锌喂养(L-NPP)组血清锌(10.87±0.43) μmol/L，脊髓锌(3.01±0.19) mg/kg；各组间比较均有统计学差异(P＜0.01)，高锌组能提高锌含量，低锌组加重缺锌状态，见图1、2。

图 1 各组小鼠血清锌的含量(μmol/L， n=6)aP＜0.01， 各组间比较Fig. 1 Serum zinc level in different groups(μmol/L, n=6)aP＜0.01， vs each group

图 2 各组小鼠脊髓锌的含量(mg/kg， n=6)aP＜0.01， 各组间比较Fig. 2 Serum zinc level in spinal cord of different groups(mg/kg, n=6)aP＜0.01， vs each group

2 SP阳性率比较 SP阳性反应产物呈棕褐色颗粒状，主要表达在脊髓后角的灰质浅层。与对照组相比，其他三组NPP动物脊髓后角的SP阳性颗粒均显著增多，平均光密度(AO)值均增高(P<0.01)。其中，L-NPP组的SP阳性颗粒最密集，AO值最高；H-NPP组的阳性颗粒最少，AO值最低(P<0.01)，见图3、4。

图 3 SP在各组模型动物脊髓的表达(免疫组化，×200) A： 低锌喂养组； B： 高锌喂养组; C： 正常喂养的NPP组; D： 对照组模型动物Fig. 3 Expression of substance P in L-NPP group (A), H-NPP group (B), N-NPP group (C) and control group (D)(immunohistochemistry, ×200)

图 6 各组小鼠脊髓SP表达的免疫印迹图像分析结果(n=6)aP＜0.01， 各组间比较Fig. 6 Immune blotting showing expression of substance P in spinal cord of different groups(n=6)aP＜0.01, vs each group

3 各组SP蛋白免疫印迹比较 图像分析显示：与对照组相比，其他三组NPP动物脊髓中的SP蛋白表达均显著增高(P<0.01)。其中，L-NPP组SP蛋白的表达最高，而H-NPP组SP蛋白的表达最低(P<0.01)，见图5、6。

讨 论

实验表明，锌离子可能与NPP的产生与传导存在着十分密切的关系。Velázquez等[4]和Zhang等[5]发现，在脊髓和背根神经节的神经元中在丰富的金属硫蛋白-Ⅲ和游离锌离子，而且，在脊髓后角和背根神经节中分布有大量的含锌初级传入神经元。Wenzel等[6]发现，当神经冲动传导到含锌神经元的轴突终末时，储存在轴突终末突触小泡中的锌离子能够与神经递质或神经调质一同释放，从而影响突触后神经元的兴奋或抑制。Jo等[7]研究发现，小鼠在进行脊神经背根切断手术后，机械痛阈显著降低，出现痛觉过敏现象；而且，在脊髓背角灰质浅层当中的锌离子显著减少。本研究中也发现，坐骨神经分支选择性损伤后，小鼠血清和脊髓中的锌离子含量显著减少，分析出现这种情况的原因可能有三个：第一，坐骨神经分支切断后，从神经末梢摄入到背根神经节中的锌显著减少，造成其在脊髓后角的释放减少；第二，神经损伤时，由于伴随神经递质在脊髓的大量快速耗竭，造成脊髓中的锌减少；第三，外周神经损伤时，大量炎性物质的释放导致肾脏排泄锌加快，锌从血清中转运到肝脏等器官储存起来，因此造成血清锌减少；而NPP时锌离子含量的减少也提示着锌可能与NPP存在着某种密切的关系。

研究发现，脊髓后角P物质(substance P，SP)表达上调是NPP的重要机制[8-10]，SP在脊髓的表达变化也被作为研究NPP发病机制的观察指标之一。在脊髓内，SP主要分布于后角的灰质浅层，尤其是在一些直径较细的伤害性初级传入神经纤维的末梢部位，当它被释放就能与突触后神经元的神经激肽受体1结合，从而在痛觉的产生与传递中发挥重要的作用[11-13]。研究发现，在大鼠的后爪足底进行手术切口能使动物脊髓后角SP表达增多[14]；鞘内应用SP后，动物的热痛阈显著降低，出现热痛觉过敏现象，提示SP能参与伤害性信息在脊髓中的产生与传递，从而产生致痛作用[15]。本研究发现，坐骨神经分支选择性损伤时，小鼠脊髓后角浅层的SP表达增多，提示SP在脊髓后角的高表达参与了NPP的产生与传导过程。此外，我们还发现，高锌喂养能使血清和脊髓中的锌含量增高，SP表达降低；低锌喂养可致SP表达增高，提示锌可能抑制了SP在NPP模型动物脊髓中的表达。

总之，本研究发现坐骨神经分支选择性损伤时，低锌喂养可以使血清和脊髓中的锌离子浓度更低，SP表达更高；而高锌喂养能使血清和脊髓中的锌离子浓度增加，SP表达降低；提示锌可能抑制了脊髓后角SP的表达。但是，锌离子在NPP中的作用机制还有待于进一步研究。

1 Hussain AM， Khan MA. Pain management after traumatic spinal cord injury［J］. J Coll Physicians Surg Pak， 2012， 22（4）： 246-247.

2 Fornasari D. Pain mechanisms in patients with chronic pain［J］.Clin Drug Investig， 2012， 32（Suppl 1）：45-52.

3 Bring DK， Paulson K， Renstrom P， et al. Residual substance P levels after capsaicin treatment correlate with tendon repair［J］. Wound Repair Regen， 2012， 20（1）： 50-60.

4 Velázquez RA， Cai Y， Shi Q， et al. The distribution of Zinc selenite and expression of metallothionein-III mRNA in the spinal cord and dorsal root ganglia of the rat suggest a role for Zinc in sensory transmission［J］. J Neurosci， 1999， 19（6）： 2288-2300.

5 Zhang L， Chi ZH， Ren H， et al. Imunoreactivity of Zinc transporter 7（ZNT7） in mouse dorsal root ganglia［J］. Brain Res Bull， 2007， 74（4）： 278-283.

6 Wenzel HJ， Cole TB， Born DE， et al. Ultrastructural localization of zinc transporter-3 （ZnT-3） to synaptic vesicle membranes within mossy fiber boutons in the hippocampus of mouse and monkey［J］.Proc Natl Acad Sci U S A， 1997， 94（23）：12676-12681.

7 Jo SM， Danscher G， Schrøder HD， et al. Depletion of vesicular Zinc in dorsal Horn of spinal cord causes increased neuropathic pain in mice［J］. Biometals， 2008， 21（2）： 151-158.

8 Malmsjö M， Gustafsson L， Lindstedt S， et al. Negative pressure wound therapy-associated tissue trauma and pain： a controlled in vivo study comparing foam and gauze dressing removal by immunohistochemistry for substance P and calcitonin gene-related peptide in the wound edge［J］. Ostomy Wound Manage， 2011， 57（12）： 30-35.

9 Roche M， Kerr DM， Hunt SP， et al. Neurokinin-1 receptor deletion modulates behavioural and neurochemical alterations in an animal model of depression［J］. Behav Brain Res， 2012， 228（1）： 91-98.

10 Lin CC， Chen WN， Chen CJ， et al. An antinociceptive role for substance P in acid-induced chronic muscle pain［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2012， 109（2）： E76-E83.

11 Brink TS， Pacharinsak C， Khasabov SG， et al. Differential modulation of neurons in the rostral ventromedial medulla by neurokinin-1 receptors［J］. J Neurophysiol， 2012， 107（4）：1210-1221.

12 Bie B， Zhao ZQ. Peripheral inflammation alters desensitization of substance P-evoked current in rat dorsal root ganglion neurons［J］.Eur J Pharmacol， 2011， 670（2-3）： 495-499.

13 Wang YJ， Li XF， Ding F， et al. Noradrenaline regulates substance P release from rat dorsal root ganglion neurons in vitro［J］. Neurosci Bull， 2011， 27（5）： 300-306.

14 胡兴国，钟敏，曾因明．鞘内注射新斯的明对手术切口引起的大鼠脊髓背角P物质表达的影响［J］.中国疼痛医学杂志，2005，11（2）：96-99．

15 Wajima Z， Hua XY， Yaksh TL. Inhibition of spinal protein kinase C blocks substance P-mediated hyperalgesia［J］. Brain Res， 2000，877（2）： 314-321.