固相萃取-超高效液相色谱法测定浓缩石榴汁中羟甲基糠醛含量

刘学芝，何 强，孔祥虹，杜宝中

（1.西安理工大学应用化学系，陕西西安710054；2.陕西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，陕西西安710068）

羟甲基糠醛（hydroxymethylfurfural，HMF）是葡萄糖、果糖等化合物在高温或弱酸条件下脱水产生的醛类化合物，会使果汁的色值变小，口感变差，对人体有毒副作用[1]。浓缩石榴汁因其营养价值和保健作用越来越受到人们的欢迎，检测浓缩石榴汁中羟甲基糠醛，对于评价石榴汁品质和安全性具有重要意义。欧盟果蔬汁饮料工业协会（AIJN）规定果汁中羟甲基糠醛的最大残留限量为20mg/L；国际果汁加工联合会（IFFJP）建议浓缩果汁中最大残留限量为25mg/L[2]。羟甲基糠醛的测定方法主要有液相色谱法[3-7]、紫外分光光度法[8]、气相色谱-质谱法[9]、液相色谱-串联质谱法[10-11]等。但浓缩石榴汁中羟甲基糠醛的测定尚未见有文献报道。由于石榴汁样品基质较复杂，采用常用的直接稀释后测定方法[5-6]时存在干扰，本研究建立了一种利用新型聚合物固相萃取柱净化，超高效液相色谱快速检测浓缩石榴汁中羟甲基糠醛的方法，该方法简便、快速、准确。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙腈、甲醇 均为色谱纯，德国Merck公司；羟甲基糠醛标准品 纯度＞97%，美国Sigma公司；实验用水 均为超纯水；浓缩石榴汁 均为果汁厂送检样品。

Acquity UPLC超高效液相色谱仪（配PDA检测器）、UPLC HSS T3色谱柱（100mm×2.1mm，1.8μm）美国Waters公司；Milli-Q超纯水制备仪 美国Millipore公司；IKA®VORTEX GENIUS 3涡旋混合器 德国IKA公司；50mL具塞塑料离心管 美国corning公司；Bond Elut ENV固相萃取柱 500mg，6mL，美国Agilent公司；0.22μm有机系微孔滤膜 天津市津腾实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 称取2.5g（精确至0.01g）样品置于50mL离心管中，加入20mL水，涡旋溶解。将Bond Elut ENV固相萃取柱依次用5mL甲醇、10mL水活化，将样品溶液全部上样，用5mL水洗涤离心管，洗涤液也合并上样，待上样液流至近干后，用5mL水淋洗，弃去全部流出液，用25mL甲醇-水溶液（2+8，V/V）洗脱，整个固相萃取净化过程保持流速2～3mL/min，收集洗脱液，用超纯水定容至50mL，过0.22μm微孔滤膜，待测定。

1.2.2 标准溶液配制

1.2.2.1 标准储备液 称取10mg（精确至0.1mg）羟甲基糠醛标准品，用乙腈溶解并定容至10mL，配制成质量浓度为1.0mg/mL的标准储备液，于-20℃冰箱中保存。

1.2.2.2 系列标准溶液 用乙腈-水（8+92，V/V）将标准储备液逐级稀释，配制浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的羟甲基糠醛系列标准溶液，于4℃冰箱中保存待用。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱（100mm×2.1mm，1.8μm）；流动相：乙腈-水（8+92，V/V），流速：0.3mL/min；柱温：35℃；样品室温度：15℃；检测波长：285nm；进样量：10μL。标准溶液超高效液相色谱图如图1所示。

图1 羟甲基糠醛标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of HMF standard

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

主要对色谱柱、流动相进行了考察，在色谱柱选择时，比较了BEH C18、HSS T3两种色谱柱，由于羟甲基糠醛的极性较大，在BEH C18色谱柱上出峰时间较早（1.5min左右出峰），而HSS T3色谱柱（2.0min左右出峰）填料上特殊的键合相更有利于极性化合物的保留，可显著改善羟甲基糠醛的色谱保留及分离情况。在流动相选择时比较了甲醇-水系统和乙腈-水系统，发现在比例相同时乙腈-水系统出峰较快，峰形较好，色谱分离也较好，最终选择HSS T3色谱柱分离，乙腈-水（8+92，V/V）为流动相。

2.2 前处理条件的考察

浓缩石榴汁中主要含有糖、有机酸、色素、植物蛋白等物质，直接稀释进样测定时干扰大，而由于羟甲基糠醛极性大，采用液液萃取不能达到有效去除糖类物质、有机酸等干扰成分的目的。C18、氨基等填料的固相萃取柱回收率分别为70%、62%，均不能有效的将羟甲基糠醛与基质干扰杂质有效去除，通过实验比较，发现Bond Elut ENV固相萃取柱的回收率（92%）与净化效果良好，浓缩石榴汁样品直接稀释进样与经Bond Elut ENV固相萃取柱净化后进样见图2，样品净化效果明显。

图2 浓缩石榴汁样品净化前后色谱图Fig.2 Chromatogram of pomegranate juice concentrate

在确定采用Bond Elut ENV固相萃取柱净化后，分别对上样量、淋洗条件、洗脱条件进行了考察。分别称取浓缩石榴汁2.5、5.0、7.5g，每个质量3个平行样，均添加标准品100μg，结果表明，称样量为7.5g时的回收率（60%）明显低于称样量为2.5、5.0g的回收率（92%、85%），分析可能是由于萃取柱的载样量有限，称样量大时会造成萃取柱过载，使回收率降低。为确保测定结果准确性，选择称样量为2.5g。淋洗时选择水为淋洗液，5mL水基本能够把SPE小柱上的糖类、有机酸等极性大的物质淋洗下来。洗脱时分别考察了体积比为10%、20%、30%的甲醇-水溶液，结果表明，三种比例的洗脱剂用量均为25mL时，20%、30%的甲醇-水溶液能够将柱上的羟甲基糠醛洗脱完全，而10%的甲醇-水需要加大洗脱体积至35mL才能洗脱完全，而图3反映了3种洗脱剂的洗脱效果，其中30%甲醇-水洗脱杂质较多，10%和20%甲醇-水洗脱杂质少，净化效果较好。综合考虑选择20%甲醇-水作为洗脱剂。

图3 不同洗脱剂净化效果图Fig.3 Chromatogram of sample purified by different elution

表1 浓缩石榴汁中羟甲基糠醛的加标回收率和精密度数据（n=6）Table 1 Recoveries and precisions（RSDs）of 5-HMF in pomegranate juice concentrate（n=6）

2.3 线性和检出限

将浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的羟甲基糠醛系列标准溶液，按1.2.3色谱条件进样检测，以标准浓度（X，μg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标作图，用最小二乘法进行线性回归，得标准曲线回归方程为Y=23000X+2778.4（相关系数r=1.0000），在0.1～10.0mg/L范围内，羟甲基糠醛浓度与峰面积值有良好的线性关系。

以信噪比3（S/N=3）计算，羟甲基糠醛检出限为0.02mg/L，以信噪比10（S/N=10）计算，羟甲基糠醛定量限为0.07mg/L。按1.2.1中样品处理方法，浓缩石榴汁中羟甲基糠醛的检出限为0.4mg/kg，定量限为1.4mg/kg。

2.4 加标回收率和精密度

采用添加回收的方法，对浓缩石榴汁进行加标回收率测定，每个样品添加3个水平，每个添加水平重复6次，按规定的样品净化方法及超高效液相色谱检测方法进行测定，该方法的回收率及精密度数据如表1所示，3个加标水平的回收率RSD均低于8.1%，满足测定要求。

2.5 实际样品的测定

采用所建立方法对16批浓缩石榴汁进行测定，结果表明，这16批浓缩石榴汁中羟甲基糠醛含量在8.3～32.6mg/kg范围内。

3 结论

羟甲基糠醛含量是评价果汁品质的重要指标，本文建立了采用Bond Elut ENV固相萃取柱净化，UPLC法快速测定浓缩石榴汁中羟甲基糠醛。该方法准确、简便、快速，适用于浓缩石榴汁样品中羟甲基糠醛的测定。

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