海风藤对β淀粉样蛋白寡聚体激活小胶质细胞的影响

马艳 邢华医 马学强 郑梅梅 杜怡峰

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）发病机制有多种假说，小胶质细胞引起的炎性反应在AD形成过程中起重要作用，β淀粉样蛋白（amyloid beta protein，Aβ）能与特异性受体结合使小胶质细胞激活、增殖，并分泌释放大量炎性因子和神经毒性物质，从而引起中枢神经系统损伤，其中白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6）为 Aβ发挥毒性作用的重要调节因子［1］。本研究采用Aβ寡聚体或（和）海风藤提取物对小胶质细胞进行干预，并测量小胶质细胞培养上清液中IL-1β和IL-6的水平，旨在探讨海风藤提取物对Aβ寡聚体激活小胶质细胞的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器 SPF级新生1～2d的Wistar大鼠（山东大学实验动物中心提供），Aβ25-35（首都医科大学宣武医院老年病研究所赠送），六氟异丙醇（HFIP），二甲基亚砜（DMSO，购自Sigma公司），PBS缓冲液、大鼠IL-1β和IL-6ELISA试剂盒（购自上海依科赛），海风藤提取物（山东大学药学院提供），H-800型电子显微镜（日本日立公司，山东师范大学提供）。

1.2 方法

1.2.1 Aβ25-35寡聚体的制备：将 Aβ25-35利用HFIP溶解成1mg／mL的溶液，于室温下孵育24 h，然后置生物安全柜中使HFIP完全蒸发，完成Aβ25-35的单体化，再用DMSO把单体化的Aβ25-35溶解成1mmol／L，然后用PBS缓冲液稀释成40μmol／L，置4℃孵育48h。同时设立空白对照组，只加DMSO和PBS，不加 Aβ25-35。

1.2.2 Aβ寡聚体的鉴定：用透射电镜观察制备的寡聚体。取5μL样本将其吸附到200网的铜网上，在空气中风干后用蒸馏水洗涤1min，用2%（质量浓度）磷钨酸（pH 6.8）溶液染色2min，再用蒸馏水洗涤，风干后用透射电镜观察，由山东师范大学电镜室教授操作，加速电压为100kV，透射电镜放大倍数为8万～10万观察。

1.2.3 小胶质细胞的培养和分组：将新生的Wistar大鼠于无菌环境下开颅取脑，剥除脑膜和血管，经机械剪碎、胰酶消化后制备成混合细胞悬液，在MEM完全培养基中培养7～9d后，水平手摇3～5min分离小胶质细胞，以CD11b（为小胶质细胞的特异性表面标志物）鉴定小胶质细胞。将原代培养的小胶质细胞随机分为4组，每组设5个平行孔：（1）空白对照组：无任何干预处理；（2）Aβ25-35寡聚体组：给予 Aβ25-35寡聚体干预，Aβ25-35寡聚体终浓度为10μmol／L；（3）Aβ25-35寡聚体＋海风藤提取物组：在Aβ25-35寡聚体组处理的基础上同时给予海风藤提取物干预，海风藤提取物终浓度为20g／L；（4）Aβ25-35寡聚体＋DMSO 组：在Aβ25-35寡聚体组处理的基础上同时给予DMSO干预，DMSO终浓度为0.5%。48h后，收集上清液，用ELISA试剂盒测上清液中IL-1β和IL-6的水平，按说明书步骤操作。

1.3 统计学处理 用SPSS16.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，均数间比较采用单因素方差分析（ANOVA），均数间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电镜观察 所制备的Aβ寡聚体直径10～20nm，没有观察到纤丝状物质；而空白对照电镜下观察的视野为空白（图1）。

图1 透射电镜下观察Aβ寡聚体的形态（比例尺为100nm）

2.2 各组IL-1β和IL-6表达比较 与空白对照组相比，Aβ寡聚体刺激小胶质细胞48h后，其上清液中IL-1β、IL-6的水平明显增加（P＜0.05），而Aβ寡聚体＋海风藤提取物组上清液中IL-1β、IL-6的水平低于Aβ寡聚体组（P＜0.05），Aβ寡聚体＋DMSO组上清液中IL-1β、IL-6水平与 Aβ寡聚体组比较无统计学差异（P＞0.05）（表1）。

表1 各组细胞上清液IL-6、IL-1β水平比较（±s，n＝5，pg／mL）

表1 各组细胞上清液IL-6、IL-1β水平比较（±s，n＝5，pg／mL）

注：与空白对照组和Aβ寡聚体＋海风藤组比较，＊P＜0.05

组 别 IL-6 IL-1β空白对照组110.9±4.62 36.30±1.40 Aβ寡聚体组 181.14±4.46＊ 67.06±1.79＊Aβ寡聚体＋海风藤组 170.34±3.47 63.24±2.00 Aβ寡聚体＋DMSO组 184.7±6.06 68.26±1.38 F值315.60 491.02 P值 ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

体外制备Aβ寡聚体的方法有多种，所制备的寡聚体在大小、稳定性、可重复性等方面各不相同。本研究参考Stine等［2］和 Andrea等［3］的方法制备Aβ寡聚体。HFIP能破坏β折叠、疏水作用，促进α螺旋、无规则卷曲形成，在制备Aβ寡聚体的过程中，用HFIP处理Aβ的目的是去除冻干粉状Aβ中存在的二级结构，使其形成化学和结构都一致的Aβ单体。本研究用PBS缓冲液孵育Aβ，使其在生理离子强度和中性pH值条件下生成寡聚体，所制备的寡聚体直径为10～20nm，未发现纤丝状Aβ生成；而空白对照组观察视野中为空白，未发现球形Aβ寡聚体，排除了DMSO和PBS溶剂中可能存在球形物质的干扰。

Aβ寡聚体的神经毒性作用之一是能激活小胶质细胞引起炎性反应。Aβ寡聚体可通过c-Jun氨基末端激酶（JNK）、促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）、Janus激酶／信号转导和转录激活子（JAK／STAT）等途径激活小胶质细胞，从而产生炎性反应［4－6］，小胶质细胞激活后分泌释放大量炎性细胞因子和神经毒性物质如IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β（TGF-β）、S-100β、活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）和谷氨酸盐等，引起中枢神经系统的损伤［1］。Aβ刺激小胶质细胞产生IL-1β是炎性反应的始动环节，IL-1能通过刺激β-APP基因的启动子来上调神经元对β－APP的表达，因而促进老年斑的形成［7］。

本研究初步探讨了海风藤提取物对Aβ寡聚体诱导小胶质细胞激活的作用。结果显示Aβ寡聚体能激活小胶质细胞释放炎性因子IL-1β和IL-6，提示Aβ在聚集成纤维之前就已经具有毒性。Sondag等［8］和Izumi等［9］的研究表明 Aβ能激活小胶质细胞释放细胞因子，但Aβ的构象决定了释放的细胞因子的性质。

近年来对海风藤及其有效成分的药理作用及机制进行了大量的实验研究，结果表明海风藤具有明显的抗炎作用，海风藤的乙酸乙酯部位、正丁醇部位和挥发油部位能明显抑制炎性反应［10］。海风藤能够抑制植物凝血素刺激T细胞增殖，抑制T细胞的炎性因子如IL-2、IL-4、INF-γ等的 mRNA表达［4］，并且能够通过抑制环氧合酶-1（COX-1）减少前列腺素和白细胞三烯的生物合成［5］；另外，海风藤酮对急性胰腺炎合并肺损伤大鼠炎性反应产生的介质，如血小板活化因子（PAF）、TNF-α、IL-6也有明显的抑制作用［6］。庞在英等［11］研究结果也显示海风藤提取物能明显改善D-半乳糖脑老化模型小鼠的学习和记忆能力。本研究结果表明，制备海风藤提取物时所用的溶剂DMSO对小胶质细胞释放IL-1β、IL-6无明显影响，海风藤提取物对 Aβ寡聚体诱导的小胶质细胞激活的作用来自海风藤，而与DMSO无关；海风藤提取物能抑制Aβ寡聚体激活小胶质细胞释放炎性反应因子IL-1β和IL－6。目前海风藤抑制小胶质细胞激活的有效成分尚未明确，机制还不是很清楚。

综上所述，海风藤提取物能明显抑制Aβ寡聚体诱导小胶质细胞的激活，具有抗炎作用，而Aβ引起的炎性反应在AD发病中具有重要作用，提示海风藤提取物在AD的治疗中有着重要的应用价值，值得进一步研究。

［1］韩笑峰，唐荣华，王伟.小胶质细胞在阿尔茨海默病发病机制中的作用［J］.国外医学·神经病学神经外科学分册，2004，31（2）：114-116.

［2］Stine Jr WB，Dahlgren KN，Krafft GA，et al.In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis［J］.J Biol Chem，2003，278：11612-11622.

［3］Andrea T，Fabiana M，Adriana M，et al.Neuroprotective effects of cyanidin 3-O-glucopyranoside on amyloid beta（25-35）oligomer-induced toxicity［J］.Neurosci Lett，2010，473：72-76.

［4］Huang C，Ma R，Sun S，et al.JAK2-STAT3signaling pathway mediates thrombin-induced proinflammatory actions of microglia in vitro［J］.Neuroimmunology，2008，204（1／2）：118-125.

［5］Angela M，Bodles，Steven W.Secretedβ-amyloid precursor protein activates microglia via JNK and p38-MAPK［J］.Neurobiol Aging，2005，26（1）：9-16.

［6］杨丽玲，王璐，任晓燕，等.JAK／STAT途径介导Aβ寡聚体诱导小胶质细胞TNF－α的释放［J］.山东大学学报（医学版），2010，48（7）：33-36.

［7］Toro VC，Tehranian R，Zetterstorm M，et al.Increased gene expression on interleukin-1alpha and interleukin 6in rat primary glial cells induced by beta-amyloid fragment［J］.J Mol Neurosci，2001，17（3）：341-350.

［8］Sondag CM，Dhawan G，Combs CK.Beta amyloid oligomers and fibrils stimulate differential activation of primary microglia［J］.J Neuroinflammation，2009，6：1.

［9］Izumi M，Pavel IZ，Heike W，et al.Amyloid-βprotein oligomer at low nanomolar concentrations activates microglia and induces microglial neurotoxicity［J］.J Biol Chem，2011，286：3693-3706.

［10］李吉莹，刘艳菊，邴飞虹，等.海风藤抗炎作用的实验研究［J］.湖北中医杂志，2006，28（12）：17.

［11］庞在英，李桂荣，杜怡峰.海风藤提取物对D－半乳糖脑老化模型小鼠行为学、海马神经细胞线粒体膜电位及凋亡的影响［J］.中国老年学杂志，2007，27（16）：1555-1557.