U251和U87细胞的Ezrin蛋白生物信息学分析

刘乃杰 梁华新 秦治刚 孙利波 房晓萱 赵丛海 朱庆三

(吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 130033)

应用蛋白质组学和免疫组化检测发现，在不同来源的转移性肿瘤中，Ezrin蛋白高表达〔1～3〕。相对于良性上皮组织膜顶端的表达，胞浆高表达的Ezrin与人类乳腺癌去分化、侵袭和不良预后有关〔4〕。应用shRNA和Ezrin负调控区突变抑制 Ezrin功能，可阻止侵袭和早期转移〔5～7〕。研究发现Ezrin基因过表达与儿童横纹肌肉瘤和骨肉瘤临床分期相关，移植瘤模型证实减少横纹肌肉瘤或骨肉瘤细胞系Ezrin的表达可导致肺转移减少〔8〕。神经胶质瘤因其浸润性生长，使手术及放化疗效果均不理想。Tynninen等〔9〕研究发现Ezrin同样在神经胶质瘤高表达，且与神经胶质瘤的进展相关，与组织学细胞类型和WHO肿瘤等级相关。但不同肿瘤等级、不同浸润性神经胶质瘤Ezrin表达量不同的机制不清楚。本文对侵袭性不同的胶质瘤细胞系U87和U251的Ezrin蛋白序列进行生物信息学分析，拟寻找浸润性生长的机制，为神经胶质瘤的治疗寻求新的途径。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 组织RNA提取试剂盒、小量质粒提取试剂盒，北京博迈德科技发展有限公司;M-MLV反转录酶，Promega公司;Ribonuclease Inhibitor、dNTP Mixture、Oligo d(T)15Primers、Random Primers、TaKaRa LA Taq®Hot Start Version、pMD®18-T vector、DL2000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ，宝生物工程(大连)有限公司;DEPC，Sigma公司。U251、U87细胞购自中国科学院细胞库。应用Primer Premier 5.0软件设计Ezrin基因的引物:EF216:5'-CTCGAGCTATGCCGAAACCAATCAATGTCCG-3'，ER1976:5'-GAATTCTTACAGGGCCTCGAACTCGTCGATG-3'，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 基因序列及蛋白结构分析工具 Basic Local Alignment Search Tool(nucleotide blast及 blastx)，EBI＞Tools＞Protein，SWISS-MODEL，SWISS-PDB Viewer。

1.3 方法

1.3.1 Transwell检测U251和U87细胞的迁移侵袭能力 取100 μl Matrix gel加至 Transwell小室中，置 37℃，待其凝固。0.25%胰酶消化收集细胞，计数，吸取100 μl(含1×105个细胞)加至Matrix gel表面，于37℃继续培养4～6 h，结晶紫染色，计数穿过膜底面的细胞。

1.3.2 Ezrin基因的钓取、克隆及鉴定 0.25%胰酶消化，收集细胞1×107，用组织RNA提取试剂盒提取细胞RNA，定量后，反转录合成 cDNA。反应体系:10 × buffer 2 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μl，RNase Inhibitor(40 U)0.5 μl，Oligo d(T)15Primers 1 μl，Random Primers 1 μl，RNA 1 μg，M-MLV 1 μl，补加free-RNase H2O至20 μl。反应条件:37℃ 1 h。取上述合成的cDNA PCR扩增Ezrin基因，配制25 μl反应体系:10倍缓冲液2.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μl，引物 EF216(10 pmol/L)、ER1976(10 pmol/L)各 1 μl，TaKaRa LA Taq®Hot Start Version 0.5 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 16 μl。按下列条件进行反应:94℃30 s，58℃ 2 min，72℃ 30 s，35 个循环，72℃ 5 min。1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物并回收，进行TA克隆。37℃过夜培养后，挑取单菌落摇菌，小量提取质粒，XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定。

1.3.3 Ezrin基因测序及序列分析 选取阳性质粒测序，由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。应用Basic Local A-lignment Search Tool(nucleotide blast)分析所测得的序列，判断其与GenBank登陆的序列的相似性。再应用Local Alignment Search Tool(blastx)分析所测序列氨基酸变异情况。

1.3.4 U87和U251细胞Ezrin蛋白结构分析及预测 应用EBI＞Tools＞Protein和 SWISS-MODEL在线分析 U87和 U251细胞Ezrin蛋白功能、结构域、空间结构差异;应用SWISS-PDB Viewer分析变异氨基酸的位置。

2 结果

2.1 Transwell检测U251和U87细胞的迁移侵袭能力 Transwell检测结果可见，穿过膜底面的U87细胞为(35.5±6.89)个，明显高于U251细胞〔(13.3±3.01)个〕(P＜0.001)。表明U87的迁移、浸润能力强。见图1。

2.2 U251和U87细胞系Ezrin基因的钓取、克隆及鉴定 1%琼脂糖凝胶电泳显示，RT-PCR扩增产物为1 700 bp，与Ezrin基因的大小相符(图2)。切胶回收该PCR产物，TA克隆。应用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，电泳显示在图3a泳道10和12、图3b泳道2在1 700 bp处有一DNA条带，表明其质粒为阳性克隆载体。

2.3 Ezrin基因测序及序列分析 选取图3中的阳性质粒测序，应用Basic Local Alignment Search Tool(nucleotide blast)分析显示，所测得的U251和U87细胞Ezrin基因序列与GenBank登陆序列的相似性为99%，U251细胞Ezrin基因序列中有一个位点突变，U87细胞有5个位点。应用 Local Alignment Search Tool(blastx)分析Ezrin氨基酸，U251细胞Ezrin第407位氨基酸变异，U87细胞Ezrin在第66、258、265和577位变异。

图1 Transwell检测U251和U87细胞的迁移侵袭

图2 RT-PCR扩增U251和U87细胞系Ezrin基因

图3 XhoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定Ezrin基因的TA克隆

2.4 U87和 U251细胞 Ezrin蛋白功能、结构分析 应用EBI＞Tools＞Protein在线分析 U87和 U251细胞 Ezrin蛋白功能，与U87细胞 Ezrin匹配的蛋白有1 503个，与 U251细胞Ezrin匹配的蛋白却有362个。Ezrin的结构分析显示，蛋白质结构数据库PDB中U87细胞Ezrin的数量多于U251细胞，而蛋白质结构等级分类显示的结构域的结构分级和分层分级相同。U 87细胞Ezrin的结构域有45个，而U251细胞的Ezrin只有5个。

2.5 SWISS-MODEL建模分析变异氨基酸的位置 应用SWISS-MODEL分析，U87细胞Ezrin的3D空间结构有8处与U251细胞不同，QMEAN4评分U87细胞Ezrin低于U251细胞(表1)。SWISS-PDB Viewer显示U87细胞 Ezrin第258、265位氨基酸相对位于空间结构的内侧。

表1 Ezrin蛋白QMEAN4评分

3 讨论

Ezrin是ERM家族成员之一。ERM蛋白质是高度保守的〔10〕，从进化上，不同种类动物ERM都有着相同的蛋白质结构，由氨基末端FERM、富含α-螺旋区和含有F-肌动蛋白结合位点(30个氨基酸)的羧基末端组成，这些结构域的同源可达约76%。生化研究表明，ERM蛋白通过N-末端和C-末端约100个氨基酸称为N-/C-ERMAD的结构域相互作用，屏蔽其与肌动蛋白和膜的结合位点，对ERM蛋白进行负调控。X-射线显示FERM结构域由包括一个与羧基末端结合的折叠的PTB/PH/EVH1的三叶草状排列的F1、F2和F3，掩蔽一个大的FERM结构〔11〕。Li等〔10〕研究的最新数据表明丰富的α中央螺旋结构与FERM的F1和F2的连接区的相互作用对屏蔽结合位点，特别是与磷酸肌醇结合的位点具有重要作用。表明任何ERM蛋白的调控因子结合α-螺旋区可能会导致构象的变化，因此，在激活过程中也会出现。ERM蛋白的激活是由信号传导严格调控的。

越来越多的证据证明ERM蛋白在肿瘤进展中的作用。基因和蛋白质表达分析显示Ezrin在各种人类和啮齿动物肿瘤中的表达与良性的组织对比显著增加〔5，12～15〕。Ezrin在胞质表达量增加与人类乳腺癌去分化、侵袭性和不良预后有关〔3〕。并且在同一肿瘤的不同临床分期，Ezrin的表达量显著不同。大量研究证实Ezrin在肿瘤组织的激活、表达，参与肿瘤细胞迁移侵袭，是受信号分子调控的〔16～18〕。本研究推测Ezrin蛋白在肿瘤组织中变异影响其自身结构，从而导致细胞迁移侵袭能力不同。因此，本研究对具有不同侵袭能力的脑胶质瘤细胞U251和U87的Ezrin蛋白功能和结构进行生物信息学分析来加以证明。应用Basic Local Alignment Search Tool(nucleotide blast)分析显示，U251和U87细胞Ezrin基因序列与GenBank登陆序列的相似性为99%，U251细胞Ezrin基因序列中有一个位点突变，U87细胞的有5个位点，均导致相应的氨基酸变异，即U251细胞Ezrin第407位氨基酸变异，U87细胞Ezrin第66、258、265和577位变异。本研究表明U87细胞Ezrin氨基酸变异多于U251细胞，导致其功能、结构域及空间结构不同，从而影响U87、U251细胞的迁移和浸润能力不同。

1 Cui Y，Wu J，Zong M，et al.Proteomic profiling in pancreatic cancer with and without lymph node metastasis〔J〕.Int J Cancer，2009;124(7):1614-21.

2 Belbin TJ，Singh B，Smith RV，et al.Molecular profiling of tumor progression in head and neck cancer〔J〕.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2005;131(1):10-8.

3 Sarrió D，Rodríguez-Pinilla SM，Dotor A，et al.Abnormal ezrin localization is associated with clinicopathological features in invasive breast carcinomas〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2006;98(1):71-9.

4 Baumgartner M，Sillman AL，Blackwood EM，et al.The Nckinteracting kinase phosphorylates ERM proteins for formation of lamellipodium by growth factors〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2006;103(36):13391-6.

5 Yu Y，Khan J，Khanna C，et al.Expression profiling identifies the cytoskeletal organizer ezrin and the developmental homeoprotein Six-1 as key metastatic regulators〔J〕.Nat Med，2004;10(2):175-81.

6 Khanna C，Wan X，Bose S，et al.The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis〔J〕.Nat Med，2004;10(2):182-6.

7 Elliott BE，Meens JA，SenGupta SK，et al.The membrane cytoskeleton crosslinker ezrin is required for metastasis of breast carcinoma cells〔J〕.Breast Cancer Res，2005;7(3):R365-73.

8 Niqqli V，Rossy J.Ezrin/radixin/moesin:Versatile controllers of signaling molecules and of the cortical cytoskeleton〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2008;40(3):344-9.

9 Tynninen O，Carpén O，Jääskeläinen J，et al.Ezrin expression in tissue microarray of primary and recurrent gliomas〔J〕.Neuropathol Appl Neurobiol，2004;30(5):472-7.

10 Li Q，Nance MR，Kulikauskas R，et al.Self-masking in an intact ERM-merlin protein:an active role for the central alpha-helical domain〔J〕.J Mol Biol，2007;365(5):1446-59.

11 Arpin M，Chirivino D，Naba A，et al.Emerging role for ERM proteins in cell adhesion and migration〔J〕.Cell Adh Migr，2011;5(2):199-206.

12 Bruce B，Khanna G，Ren L，et al.Expression of the cytoskeleton linker protein ezrin in human cancers〔J〕.Clin Exp Metastasis 2007;24(2):69-78.

13 Song J，Fadiel A，Edusa V，et al.Estradiol-induced ezrin over-expression in ovarian cancer:a new signaling domain for estrogen〔J〕.Cancer Lett，2005;220(1):57-65.

14K¨obel M，Langhammer T，Hüttelmaier S，et al.Ezrin expression is related to poor prognosis in FIGO stage I endometrioid carcinomas〔J〕.Mod Pathol，2006;19(4):581-7.

15 Elzagheid A，Korkeila E，Bendardaf R，et al.Intense cytoplasmic ezrin immunoreactivity predicts poor survival in colorectal cancer〔J〕.Hum Pathol，2008;39(12):1737-43.

16 Belkina NV，Liu Y，Hao JJ，et al.LOK is a major ERM kinase in resting lymphocys cytoskeletal rearrangement through ERM phosphorylation〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2009;106(12):4707-12.

17 ten Klooster JP，Jansen M，Yuan J，et al.Mst4 and Ezrin induce brush borders downstream of the Lkb1/Strad/Mo25 polarization complex〔J〕.Dev Cell，2009;16(4):551-62.

18 Chirivino D，Del Maestro L，Formstecher E，et al.The ERM proteins interact with the class C-Vps/HOPS complex to regulate the maturation of endosomes〔J〕.Mol Biol Cell，2011;22(3):375-85.