microRNA-101和环氧合酶-2在胃癌中的表达及其临床意义*

邵 耘 何晓璞 丁清清 许海尘 薛绮萍 孙为豪

南京医科大学第一附属医院老年消化科(210029)

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为21～25个核苷酸的非编码单链小RNA。成熟miRNAs作为基因调控因子，通过与靶基因mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)碱基序列互补结合，使靶mRNA降解或抑制其翻译，从而在转录后水平负向调控靶基因表达［1，2］。近年研究发现 miRNAs在多种人类恶性肿瘤中表达异常，在肿瘤发生、发展中起癌基因或抑癌基因作用，并有望应用于恶性肿瘤的诊断和治疗［3，4］。miR-101 是新近发现的一种 miRNA，在肝细胞癌、结肠癌、胃癌等多种恶性肿瘤中呈低表达，而过表达外源性miR-101可发挥肿瘤抑制作用［5～8］。

胃癌是严重威胁人类健康和生命的常见恶性肿瘤之一，在癌症发病和死因中均居前列。侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学行为，也是影响治疗效果和预后的关键因素。本课题组前期研究显示环氧合酶-2(COX-2)过表达在胃癌肿瘤血管生成中起重要作用，并与胃癌侵袭、转移有关［9］，而特异性COX-2抑制剂能有效抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡［10］。关于胃癌组织中COX-2异常表达的分子机制，包括转录水平和转录后调控机制，目前尚未完全明确。有研究发现结肠癌及其肝转移灶和结肠癌细胞中miR-101表达下调而COX-2表达上调，两者呈显著负相关［11］，体外实验表明miR-101可与COX-2 mRNA的3’-UTR结合，直接抑制结肠癌细胞、前列腺癌细胞中 COX-2 的转录后表达［11，12］，提示COX-2为miR-101的直接靶基因，肿瘤细胞中miR-101低表达可能为COX-2过表达的主要原因之一。对胃癌的研究［7］亦发现上调miR-101表达可通过靶向EZH2、COX-2、Mcl-1和Fos基因抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力，但关注miR-101、COX-2表达与胃癌临床病理特征相关性的文献报道不多。本研究以实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测胃癌组织和配对癌旁非癌组织中的miR-101、COX-2 mRNA表达，通过分析两者间以及两者与胃癌主要临床病理特征的关系，探讨miR-101和COX-2在胃癌诊断、治疗中的临床意义。

材料与方法

一、标本来源

收集2010年3～12月于南京医科大学第一附属医院胃肠外科行手术切除并经病理确诊的新鲜胃癌标本30例，其中男23例，女7例，年龄41～85岁，中位年龄55岁。患者术前均未接受过非甾体消炎药治疗、化疗、放疗以及其他针对肿瘤的治疗，临床和病理资料完整。每例标本留取肿瘤组织和距肿瘤边缘5 cm以上、经病理检查证实不含癌细胞的胃黏膜组织，离体后10 min内液氮速冻，－70℃保存备用。研究方案经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准，患者本人或法定代理人签署知情同意书。

二、主要试剂和仪器

TRIzol®Reagent(Ambion®，Life Technologies Corporation)，TaqMan®miRNA ABC Purification Kit、TaqMan®MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan®Gold RT-PCR Kit、7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems®， Life Technologies Corporation)，High CapacityRNA-to-cDNA Kit、Platinum®SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX(InvitrogenTM，Life Technologies Corporation)。

三、方法

1.miRNA提取:取50 mg组织，以TRIzol®试剂匀浆，参照TaqMan®miRNA ABC纯化试剂盒说明书提取miRNA，收集含miRNA的洗脱液，－20℃保存备用。

2.总 RNA提取:取50 mg组织，参照 TRIzol®试剂说明书提取总RNA，DEPC处理水溶解RNA，紫外分光光度法测定总RNA A260、A280值，计算RNA浓度，根据 A260/A280比值检测其纯度，－80℃保存备用。

3.qRT-PCR检测miR-101、COX-2 mRNA表达

①miR-101:参照TaqMan®MicroRNA逆转录试剂盒说明书合成cDNA。参照TaqMan®Gold RT-PCR试剂盒说明书行PCR扩增，扩增体系总体积20 μL，反应条件:95℃预变性10 min;95℃变性15 s，60℃退火60 s，60℃延伸60 s，共40个循环。以内参照U6表达进行标准化。

②COX-2 mRNA:参照 High Capacity RNA-tocDNA试剂盒说明书合成 cDNA。参照 Platinum®SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX说明书行PCR扩增，扩增体系总体积25 μL，反应条件:95℃预变性2 min;95℃变性10 s，60℃退火30 s，70℃延伸45 s，共40个循环。以内参照GAPDH表达进行标准化。

PCR引物序列见表1。以2－△△Ct法分析目的基因相对表达量。

表1 PCR引物序列

四、统计学分析

结 果

一、miR-101、COX-2 mRNA 表达

绝大多数胃癌组织中miR-101表达低下，COX-2 mRNA则呈过表达;相反，除少数病例外，癌旁组织miR-101表达均明显高于相应癌组织，COX-2 mRNA则呈低表达甚至不表达(见图1)。miR-101在胃癌组织中的相对表达量明显低于癌旁组织，COX-2 mRNA在胃癌组织中的相对表达量明显高于癌旁组织，组间差异均有统计学意义;同一组织中的miR-101与COX-2 mRNA相对表达量之间差异亦有统计学意义(见表2)。

表2 胃癌组织与癌旁组织miR-101、COX-2 mRNA相对表达量比较()

表2 胃癌组织与癌旁组织miR-101、COX-2 mRNA相对表达量比较()

*与癌旁组织比较，P ＜0.01;▲与同组 COX-2 mRNA 比较，P ＜0.01

二、miR-101与COX-2 mRNA在胃癌组织和癌旁组织中表达的相关性

根据Person相关系数，胃癌组织与癌旁组织中的miR-101与COX-2 mRNA表达均呈显著负相关(癌组织:r= －0.767，P=0.000;癌旁组织:r=－0.718，P=0.000)。

三、miR-101、COX-2 mRNA表达与胃癌主要临床病理特征的关系

胃癌组织中的miR-101、COX-2 mRNA表达与肿瘤淋巴结转移和TNM分期相关，与患者性别、年龄以及肿瘤部位、组织学类型、分化程度均无相关性(见表3)。伴淋巴结转移的胃癌miR-101表达显著低于无淋巴结转移病例，COX-2 mRNA表达显著高于无淋巴结转移病例;TNMⅢ、Ⅳ期胃癌miR-101表达显著低于Ⅰ、Ⅱ期病例，COX-2 mRNA表达显著高于Ⅰ、Ⅱ期病例。提示miR-101、COX-2 mRNA表达与胃癌临床进展和转移有关。

图1 30例胃癌组织与癌旁组织miR-101、COX-2 mRNA相对表达量

表3 miR-101、COX-2 mRNA表达与胃癌主要临床病理特征的关系

讨 论

在人类肿瘤中，miRNAs表达谱改变是一个极为普遍的现象，miRNAs表达异常被认为是肿瘤发生、发展的重要原因之一［3，4］。作为最常见的恶性肿瘤之一，胃癌相关miRNAs已成为研究者关注的热点。有研究［13］发现血清 miR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34、miR-423-5p表达谱异常可作为胃癌诊断和肿瘤分期进展的生物学标记。对胃癌组织标本的检测显示，miR-141［14］、miR-143、miR-145［15］、miR-218［16］、miR-31［17］、let-7a miRNA［18］在癌组织中呈低表达，可能与胃癌发生有关;而miR-106b-25族高表达可使胃癌对转化生长因子-β(TGF-β)诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡产生抵抗［19］。

COX-2过表达是胃癌发生、发展机制中的重要环节。以结肠癌细胞、前列腺癌细胞为研究对象的体外实验表明miR-101可在转录后水平抑制COX-2表达，COX-2 为 miR-101 的直接靶基因［11，12］。本课题组前期研究［20］亦发现，miR-101与COX-2在胃癌组织和肿瘤细胞中的表达均呈负相关，体内、外实验显示外源性miR-101可抑制胃癌细胞增殖和COX-2表达，并诱导细胞凋亡，证实COX-2为miR-101的直接靶基因，miR-101可在转录后水平负向调控胃癌细胞COX-2表达，作为抑癌基因参与了胃癌的发生、发展过程。本研究在近期研究的基础上，进一步探讨miR-101与COX-2的表达变化与胃癌主要临床病理特征的关系，及其在胃癌临床诊断和预后判断中的价值。

本研究对30例胃癌组织和配对癌旁非癌组织的研究结果显示，绝大多数胃癌组织中miR-101表达低下，伴COX-2 mRNA过表达，两者呈显著负相关。值得注意的是，有极少数胃癌组织miR-101表达水平较高，伴随COX-2 mRNA低表达，两者仍呈负相关趋势。上述发现证实胃癌组织中确实存在miR-101负向调控COX-2表达的机制。已知一种miRNA可与多个靶基因mRNA的3’-UTR结合，一种编码基因mRNA亦可同时受多种miRNAs调控。关于胚胎植入的研究［21］显示，miR-101a、miR-144、miR-199a*均可能靶向调控COX-2表达。因此除miR-101外，可能还有其他miRNAs参与调控胃癌细胞中的COX-2表达。

本研究中绝大多数癌旁组织miR-101表达正常，COX-2 mRNA则呈低表达甚至不表达，两者亦呈显著负相关。推测正常组织失去miR-101对COX-2的负向调控后，COX-2呈现病理性高表达，参与组织癌变过程。miR-101与COX-2之间的负相关性有望成为胃癌临床诊断的生物学标记。

本研究还观察到胃癌组织中miR-101表达低下伴COX-2过表达与中晚期胃癌(TNMⅢ、Ⅳ期)和胃癌淋巴结转移显著相关，表明两者联合检测可能成为推测胃癌临床分期和转移潜能以及预后判断的敏感指标。

综上所述，miR-101与COX-2之间的负相关性可能有助于胃癌的临床诊断;miR-101表达低下伴COX-2过表达与胃癌临床进展和转移有关，对预后判断有一定参考价值。后续研究拟增加样本量，特别是纳入更多病理类型的胃癌标本，从而更全面地评价miR-101表达异常与胃癌临床病理特征的关系。此外，鉴于幽门螺杆菌(Hp)是胃癌的Ⅰ类致癌原，如能在样本量充足的基础上，在胃癌临床病理特征中增加是否伴有Hp感染这一因素，可能有助于更好地了解miR-101与胃癌发生、发展的关系。

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