卵巢上皮性癌组织中SFRP5基因启动子区甲基化与β-catenin蛋白表达检测

贾冬丽，李红雨，秦巧红

郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052

卵巢上皮性癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，约70%的患者就诊时已属晚期，其病死率高居妇科恶性肿瘤之首，晚期术后5 a生存率<30%，严重威胁广大女性的生命健康，因此研究卵巢上皮性癌的发生及发展机制，阻断其发病过程中的重要环节，寻找新的治疗靶点至关重要。分泌型卷曲相关蛋白5(secreted frizzled-related protein 5，SFRP5)基因作为一种抑癌基因，是Wnt/β-catenin信号传导通路的拮抗基因。目前已有乳癌、宫颈癌、结肠癌以及胃癌中SFRP5基因启动子区甲基化导致该基因沉默的报道[1-4]。作者检测了卵巢上皮性癌组织中SFRP5基因启动子区甲基化状态和β-catenin蛋白的表达，并分析二者之间的关系，探讨二者在卵巢上皮性癌发生发展中的可能机制，以期从分子水平揭示卵巢上皮性癌发生的原因。

1 材料与方法

1.1材料来源40例卵巢上皮性癌组织(21例卵巢浆液性囊腺癌、12例卵巢黏液性囊腺癌、7例子宫内膜样癌)，20例卵巢交界性上皮性肿瘤组织，20例正常卵巢上皮组织均来源于郑州大学第三附属医院妇科2009年6月至2012年3月的手术患者，患者年龄20～75岁。标本均为石蜡包埋组织，均经病理医师复核。患者术前均未接受放疗、化疗以及免疫治疗。

1.2主要试剂兔抗人β-catenin单克隆抗体(使用时按50倍稀释)，免疫组织化学SP试剂盒(SP-9000)和DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；甲基化特异性PCR试剂盒(包括PCR试剂盒和亚硫酸氢盐试剂盒)由北京天恩泽基因科技有限公司提供；甲基化引物和非甲基化引物由北京博大泰克生物技术有限公司设计合成，序列见表1。

表1 引物序列及产物大小

M：甲基化引物； U：非甲基化引物。

1.3不同组织中SFRP5基因启动子区甲基化状态检测石蜡组织8 μm厚连续切片，取10～15片装入1.5 mL离心管中，采用氯仿法提取组织DNA，然后严格按照甲基化特异性PCR试剂盒操作步骤进行DNA的亚硫酸氢盐修饰，以修饰过的DNA作为模板进行PCR扩增。配制PCR反应液，包括：修饰后的样本DNA 2 μL，10×PCR缓冲液Ⅱ 5 μL，dNTPs 4 μL，DNA聚合酶1 μL，甲基化或非甲基化上、下游引物各1 μL，去离子水加至50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性6 min；94 ℃ 30 s，退火(甲基化引物退火温度为61.8 ℃，非甲基化引物为52.7 ℃)30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统分析电泳结果。80例标本随机抽取10%进行重复实验。每例样本用甲基化引物和非甲基化引物分别进行扩增，若甲基化引物扩增出特异性条带，而非甲基化引物未扩增出特异性条带为完全甲基化；若只有非甲基化引物扩增出了特异性条带为非甲基化；若甲基化引物和非甲基化引物均扩增出了特异性条带为部分甲基化。

1.4不同组织中β-catenin蛋白的检测应用免疫组织化学SP法。3 μm厚石蜡切片常规脱蜡，梯度乙醇水化，微波抗原修复，依次加入体积分数3%甲醇过氧化氢、羊血清封闭，再依次加入一抗、二抗，各孵育40 min后，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇中和，脱水透明，中性树胶封片。以已知β-catenin阳性的癌组织切片作阳性对照，以PBS液代替一抗作空白对照。结果判定[5]：正常卵巢上皮组织中β-catenin蛋白主要表达于胞膜上，为棕黄色颗粒状。光学显微镜下选取5个视野(×400)，每个视野计数100个细胞。按阳性细胞百分比和染色强度分别评分：阳性细胞百分比<25%为0分，25%～为1分，50%～为2分，75%～为3分；无染色0分，淡黄染色1分，深黄染色2分，棕黄染色3分。取两种评分之和：0分为阴性，1～2分为弱阳性，3～4分为阳性，≥5分为强阳性；另外，>10%胞质和(或)胞核出现β-catenin表达为异位表达。阳性、强阳性为正常表达，阴性、弱阳性和异位表达皆为异常表达。

1.5统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，分别

应用确切概率法和χ2检验比较3种组织中SFRP5基因启动子区甲基化率和β-catenin异常表达率，应用Pearson列联系数分析卵巢上皮性癌组织中二者的关联性，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3种组织中SFRP5基因启动子区的甲基化状态80例组织标本均成功进行了甲基化特异性PCR检测，进入了结果分析，见图1、表2。

2.2 3种组织中β-catenin蛋白的表达见图2、表2。

图1 SFRP5基因启动子区甲基化特异性PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

图2 3种组织中β-catenin蛋白的表达(SP，×400)

表2 3种组织中SFRP5基因启动子区甲基化率和β-catenin蛋白异常表达率比较 例(%)

*确切概率；△组间两两比较，P<0.017。

2.3卵巢上皮性癌组织中SFRP5基因启动子区甲基化与β-catenin蛋白异常表达的关联性见表3。

表3 卵巢上皮性癌组织中SFRP5基因启动子区甲基化与β-catenin蛋白异常表达的关联性 例

rP=0.468,P<0.001。

3 讨论

近年来诸多研究已证实表观遗传学机制与卵巢上皮性癌的发生发展密切相关，其中DNA甲基化是重要的表观遗传学机制之一[6]。许多恶性肿瘤中抑癌基因启动子区的CpG岛发生甲基化，从而调控抑癌基因的表达，参与肿瘤的发生发展[7]。

SFRP5是SFRP家族中的一员，该家族包括5个成员：SFRP1～5，定位于染色体8p12-11.1。Qi等[3]发现结肠癌组织中SFRP5基因启动子区甲基化发生率为52.8%，发生甲基化的结肠癌细胞株经去甲基化处理后SFRP5重新恢复表达；Ho等[8]研究发现，在卵巢透明细胞癌组织和细胞株中均发现SFRP5超甲基化。该研究结果显示，SFRP5基因启动子区甲基化率在卵巢上皮性癌组织中高于卵巢交界性上皮性肿瘤组织及正常卵巢上皮组织，提示SFRP5基因启动子区甲基化状态可能导致SFRP5基因抑癌功能的减弱或丧失，进而促进卵巢上皮性癌的发生发展。

β-catenin蛋白定位于染色体3p21.3-p22，是一种多功能胞质蛋白和细胞骨架蛋白，是Wnt信号传导通路的核心元件，其介导的Wnt信号传导通路的异常激活与多种恶性肿瘤的发生密切相关[9-10]。该研究结果显示β-catenin主要定位于胞膜，可异位表达于胞质和胞核，与文献[5]报道相符。该研究结果显示β-catenin蛋白在卵巢上皮性癌组织中的异常表达率高于卵巢交界性上皮性肿瘤组织及正常卵巢上皮组织，提示β-catenin在卵巢上皮性癌组织中异常表达，可能因此激活Wnt/β-catenin信号传导通路，该机制可能在卵巢上皮性癌的发生发展中起着重要作用。

此外，该研究结果还显示，在卵巢上皮性癌组织中SFRP5基因启动子区甲基化与β-catenin异常表达有关联，提示SFRP5基因启动子区甲基化状态可能是引起β-catenin蛋白异常表达的机制之一。

总之，卵巢上皮性癌的发病机制十分复杂，SFRP5基因启动子区甲基化状态可能引起β-catenin在胞质或胞核异常积聚，并有可能因此激活Wnt/β-catenin信号传导通路；这可能为卵巢上皮性癌的预防和治疗提供了新的肿瘤标志物和治疗靶点。

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[5] 张孝艳，乔玉环，王琳，等. 宫颈癌组织中sFRP1和β-catenin的表达及其意义[J]. 中国癌症杂志,2011,21(8): 610

[6] Bell A, Bell D,Weber RS, et al. CpG island methylation profiling in human salivary gland adenoid cystic carcinoma[J].Cancer,2011,117(13):2898

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