大黄素对大鼠肾间质纤维化干预作用的实验研究

魏建波 刘 琴 钟 瑜 姜 凯 浙江省立同德医院 杭州 310012

肾间质纤维化是肾脏疾病慢性进展直至发生终末期肾病的重要因素[1]，临床有应用大黄或以大黄为主药治疗肾间质纤维化疾病[2-3]，并且取得较好疗效。笔者观察大黄提取物大黄素对大鼠肾间质纤维化防治的干预作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物 Wistar雄性大鼠60只，体质量（180±20）g，清洁级，浙江省中医药研究院动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK（浙2008-0033）。

1.2 药物和主要试剂 大黄素，成都茂辰生物科技有限公司生产；I型胶原（C-I）、Ⅲ前胶原肽（PⅢP）、透明质酸（HA）ELISA检测试剂盒购自上海瑞奇生物科技有限公司；Trizol试剂盒，购自Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 主要仪器 低温高速离心机为美国Beckman Coulter；PCR扩增仪为美国ABI公司产品；凝胶电泳仪为美国伯乐公司产品。

2 方法

2.1 大鼠造模与给药 常规饲养大鼠1周后，将60只大鼠随机分为假手术对照组、模型组及大黄素小、中、大剂量组各12只。将大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于手术台上，进行气管插管。除假手术组外，其余各组大鼠结扎左侧输尿管近肾盂段制备肾间质纤维化模型，假手术对照组行手术但不结扎。次日大黄素各组分别给予大黄素25、50和80mg/kg腹腔注射给药，1周3次，共4周。假手术对照组、模型对照组用等量生理盐水代替。

各组动物于造模后28天后，眼球取血后处死。大鼠血离心后，取血清-20℃保存备用；左侧肾脏行原位灌流去除血细胞后，肾组织液氮中冻存备用。

2.2 观察指标 ①各组大鼠生存状况并记录生存曲线。②血清 C-I、PⅢP、HA含量检测：采用ELISA方法检测血清中C-I、PⅢP、HA含量。③RT-PCR检测大鼠肾组织TGF-βmRNA的表达：采用Trizol一步法示提取组织总RNA。按逆转录试剂盒方法进行RT-PCR，mRNA定量采用半定量的RT-PCR法。引物序列如下：TGF-β 上游：5’-gaagtggatccacgagcccaag-3’，下游：5’-gctgcacttgcaggagcgcac-3’，内参照GAPDH 上游：5’-tggaatcctgtggcatccatgaaac-3’,下游：5'-acgcagctcagtaacagtccg-3’。PCR反应扩增条件为：94℃，30sec；54℃，40sec；72℃，1min；30个循环。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统对PCR产物进行定量分析，以对GAPDH相对值记录结果。

2.3 统计学方法 应用SPSS12.0统计软件，数据以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 生存曲线 记录各组大鼠实验开始至第28天的生存状况。对照组大鼠第28天时存活10只，模型组大鼠第28天仅存活4只，大黄素小剂量组、中剂量组、大剂量组大鼠到第28天时分别存活6只、7只和8只，较模型组有明显升高。见图1。

图1 各组大鼠生存曲线

3.2 大黄素对肾间质纤维化大鼠血清C-I、PⅢP、HA含量影响 与对照组比较，模型组大鼠血清C-I、PⅢP、HA含量显著升高（P均＜0.01）；与模型组比较，大黄素各组血清C-I、PⅢP、HA含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

3.3 大黄素对肾间质纤维化大鼠肾组织TGF-βmRNA表达的影响 肾组织TGF-βmRNA RT-PCR琼脂糖凝胶电泳结果见图2。将电泳条带进行凝胶成像比较分析，见图3，模型组肾组织TGF-βmRNA表达高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。大黄素各剂量组TGF-βmRNA表达与模型组比较显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 各组大鼠血清中C-I、PⅢP、HA含量比较（±s） μg/L

表1 各组大鼠血清中C-I、PⅢP、HA含量比较（±s） μg/L

注：与对照组比较，△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

n/只C-I PⅢP HA 组 别

图2 肾组织TGF-βmRNA RT-PCR凝胶电泳图

图3 大黄素对肾间质纤维化大鼠肾组织TGF-βmRNA表达的影响

4 讨论

大黄素是从大黄生药中分离提纯的有效成分之一，具有抑菌消炎、抗氧化，以及抗肿瘤、调节胃肠活动、抗肝肾纤维化等多种药理作用[4-6]。本实验采用单侧输尿管梗阻法制备肾间质纤维化模型[7]。肾间质纤维化是肾间质细胞增生，肾间质胶原过度沉积，最终导致纤维化的过程。

I型胶原（C-I）、Ⅲ前胶原肽（PⅢP）、透明质酸（HA）是观察纤维化过程的重要指标。实验结果显示，与模型组相比，大黄素能明显降低大鼠血清HA、C-I和PⅢP水平，说明大黄素有较好的抑制细胞外基质合成，促进其降解，减轻肾纤维化作用。大黄素给药组大鼠最终生存数量明显多于模型组，提示大黄素可能具有治疗肾纤维化的作用。

转化生长因子（TGF-β）是公认的促纤维化发生、发展的关键因子之一，在肾间质纤维化的进程中起重要作用［8］。本实验发现模型组大鼠肾组织TGF-βmRNA表达水平明显高于对照组，经大黄素干预治疗后，TGF-β表达显著降低，提示降低TGF-β的表达量可能是大黄素抗肾间质纤维化的作用机制之一。

［1］EddyAA.Molecularbasisofrenal fibrosis［J］.PediatrNephrol，2000，15:290-301.

［2］刘明，何学红，李林，等.大黄在慢性肾功衰竭不同阶段的应用［J］.中医药学刊，2006，24（1）：45-46.

［3］周娲，涂为平，杨丽平，等.大黄对非尿毒症慢性肾衰竭患者微炎症状态的影响［J］.南昌大学学报（医学版），2012，52（5）：62-66.

［4］严泽军，程跃，蒋军辉，等.大黄素通过非Caspase依赖通路诱导膀胱癌细胞BIU87凋亡的机制［J］.中华泌尿外科杂志，2012，33（4）：259-263.

［5］张文生，李锋，鲍军强.大黄素对LoVo细胞水通道蛋白2表达的调节效应［J］.中草药，2008，39（5）：718-723.

［6］BhadaufiaM ，Shrivastava S，Nirala SK，etaL.Emodin reverses CCL4 induced hepatic cytochrome P450（CYP）enzymatic and ultrastructural changes：The in vivo evidence［J］HepatolRes，2009，39（11）：290-300．

［7］张志新，何立群.肾小管间质纤维化动物模型的研究进展［J］.时珍国医国药，2010，21（4）：969-971．

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