LY294002抑制小细胞肺癌干细胞样细胞自我更新

易恒仲, 龙灵芝，周源，曹建国，张坚松

（1. 湖南省胸科医院, 湖南 长沙, 410013， 2. 湖南师范大学医学院，湖南 长沙, 410013 ）

小细胞肺癌约为肺癌总数的20%～25%， 在初次治疗中，对化学治疗及放射治疗敏感，但极易复发和发生远处转移，迄今小细胞肺癌患者的5年生存率仅为7%[1]。目前通过手术、化疗、放疗和综合治疗等手段仍无法进一步降低小细胞肺癌的死亡率。肿瘤干细胞( cancerr stem cells，CSCs)的发现为人们理解肿瘤发病机制提供了新视野，亦为肺癌的研究和治疗提供新的靶点和方式[2]。 耿沁等[3]从肺癌细胞系通过干细胞条件培养基悬浮培养法得到肺球体细胞中肺癌干细胞高度富集并具有致瘤性。Singh 等[2]研究表明Akt 抑制剂LY294002 具有下调干细胞标志物SOX2表达和抑制非小细胞肺癌侧群细胞自我更新作用。本文用干细胞条件培养基悬浮培养法从人小细胞肺癌NCI-H446 细胞系富集和扩增肺球体形成细胞即肺癌干细胞样细胞(lung cancer stem cell like cells, LCSLCs)， 对比观察LCSLCs 与NCI-H446 细胞系细胞Akt 蛋白磷酸化水平， 同时考察Akt 特异性抑制剂LY294002 对LCSLC 自我更新的影响。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

Akt 抑制剂LY294002 购自美国Sigma 公司。鼠抗人p-Akt (ser473) 和Akt 单克隆抗体为美国Cell signalingg 公司产品；鼠抗人β-actin 单克隆抗体购自美国Sigma 公司

1.2 细胞系与成球培养

人小细胞肺癌NCI-H446 细胞系购自上海中国科学院细胞库(中国上海市)。 细胞生长于含10%胎牛血清100U/mL 青霉素和100U/mL 链霉素的DMEM 高糖培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。 收集细胞，洗涤除去血清，然后，再用添加100 IU/mL 青霉素G、100 μg/mL 链霉素、20 ng/mL 人重组表皮生长因子、10 ng/mL 人重组碱性成纤维细胞生长因子、2%不含维生素A 的B27 添加物，1% N2添加物(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的DMEM/F12 培养基悬浮培养。 在随后的悬浮培养中，采用超低粘附6 孔细胞培养板(Corning Inc.,Corning, NY, USA)， 每孔接种细胞数不超过5000个细胞。

1.3 肺球体细胞传代培养和肿瘤球形成试验

低速温和离心收集源自NCI-H446 细胞系肺癌球形成细胞，然后，用EDTA-胰蛋白酶消化，并用吹打管机械分散细胞。 得到的单细胞悬液，离心除去消化酶，然后，重新悬浮于干细胞条件培养基中用于再次成球试验。 在球体达到50 μm 直径大小时传代(6 天)。 取上述肺球体再次成球细胞，用干细胞条件培养基， 以每毫升2000 个细胞的密度接种于6 孔超低粘附培养板。 将不同浓度的LY294002(5.0、10.0、20.0μM)添加到干细胞条件培养基中， 培养6 天后， 在Nikon Eclipse TE2000-S显微镜下计数肿瘤细胞球的个数。

1.4 裸鼠皮下成瘤实验

取SPF 级突变系雄性Balb/c-nu 小鼠(4 周龄，体重14-18g)12 只，随机分为3 组，第1 组，低细胞数组(在裸小鼠的右前肢附近的右侧皮下接种人肺癌NCI-H446 细胞系肺癌球形成细胞2000 个/只；在裸小鼠的左前肢附近的左侧皮下接种人肺癌NCI-H446 细胞系细胞10000 个/只)×4 只；第2 组，中细胞数组(在裸小鼠的右前肢附近的右侧皮下接种人肺癌NCI-H446 细胞系肺癌球形成细胞10000个/只； 在裸小鼠的左前肢附近的左侧皮下接种人肺癌NCI-H446 细胞系细胞100000 个/只)×4 只；第3 组，高细胞数组(在裸小鼠的右前肢附近的右侧皮下接种人肺癌NCI-H446 细胞系肺癌球形成细胞100000 个/只；在裸小鼠的左前肢附近的左侧皮下接种人肺癌NCI-H446 细胞系肺癌球形成细胞1000000 个/只)×4 只。 观察皮下接种部位的成瘤与否以及成瘤时间(潜伏期，最长时间点为2 个月)。

1.5 Western Blot

细胞以PBS 冲洗一遍， 加入1mL 裂解酶缓冲液(50 mM Tris-HCl pH7.4、150 mM NaCl、0.2 mM EDTA、0.2% NP-40、10% 丙三醇、1M β-Me、1 μg/mL 抑肽酶、0.5 μg/mL 抑酶醛肽、0.1 mM Na3VO4、0.5 mM 4NPP、0.5 mM NaF 及蛋白酶抑制剂) 刮取并收集细胞。 细胞裂解液经13200 × g、 4°C 条件下离心5 min， 制备全细胞提取物。 Bradford 试验(Bio-Rad Laboratories, Hercule s, CA)测定蛋白质含量。 以10～12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离提取的蛋白质，并转移至PVDF 膜。 该膜首先在PBST中以脱脂牛奶5%(w/v)进行封闭，为了进行探针检测，随后以标示的一抗孵育，轻微震动下，4°C 条件下过夜。 冲洗膜四次后，以适当的过氧化物酶标记的二抗孵育上述PVDF 膜1 h。 以增强化学发光试剂盒(Amersham Biosciences)对信号进行检测。

1.6 统计学分析

实验数据录入SPSS 15.0 for windows evaluation软件(SPSS Inc,Chicago,IL)，建立数据库，各组实验数据均用均数±标准差(mean±SD) 表示， 用One Way ANOVA 方式行方差分析。 首先进行方差齐性检验，当方差齐性时，各组均数间的两两比较用LSD 法，如果方差不齐， 对照组均数与实验组均数间的比较用Dunnett 法，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1 人小细胞肺癌NCI-H446 细胞系中LCSCs 的富集与扩增

如图1 所示， 体外培养和扩增小细胞肺癌NCI-H446 细胞系，以干细胞条件培养基，在超低粘附6 孔细胞培养板中悬浮培养6 天，细胞呈现典型非粘附三维球状生长(图1)。 因此，在本研究中，我们定义干细胞条件培养基悬浮培养得到的肺球体形成细胞为LCSLCs，并作为后续实验的模型。

图1 小细胞肺癌NCI-H446 细胞系细胞成球培养

2.2 LCSCs 具有高致瘤特性

为了证明人肺癌NCI-H446 细胞系肺球体形成细胞即本文定义的LCSCs 具有更强的体内肿瘤形成能力， 我们用不同细胞数目的人肺癌NCIH446 细胞系细胞和LCSCs 接种Balb/c-nu 免疫缺陷小鼠， 从而得到在体内成瘤的最小接种细胞数。结果表明，10000 个LCSCs 就足够稳定地形成肿瘤，然而，在相应的同一模型下至少1000000 个人肺癌NCI-H446 细胞系细胞才能稳定导致肿瘤形成，此外，成瘤的时间长短亦有很大的差别(肺球体形成细胞：23 天；NCI-H446 细胞系细胞：35 天)。 表明LCSCs 具有高致瘤性(表1)。

表1 人肺癌NCI-H446 细胞系细胞和成球细胞在Balb/cnu 免疫缺陷小鼠的异种移植瘤形成能力比较

2.3 LCSCs 组成性活化Akt

Western blot 分析结果显示： 与相应非分选细胞相比，LCSCs 组成性活化Akt，表现为Akt 高磷酸化水平(图2)。

图2 LCSCs 与非分选细胞Akt 磷酸化的比较

用抗p-Akt(ser473)抗体和抗Akt 抗体，进行Western blot 分析，β-actin 作为加样量对照。UC：非分选细胞；SFC：肺球体形成细胞。

2.4 LY294002 降低LCSCs 的Akt 蛋白磷酸化水平

Western blot 分析结果显示：Akt 特异性抑制剂LY294002 能有效降低LCSCs 的Akt 蛋白磷酸化水平(图3)。

图3 LY294002 对LCSCs 的Akt 蛋白磷酸化水平的影响

不同浓度LY294002(5.0、10.0、20.0 μM)孵 育人肺癌NCI-NCI-H446 细胞系肺球体形成细胞24 h，用抗p-Akt(Ser473)和Akt 抗体进行Western blot分析，β-actin 作为加样量对照。

2.5 LY294002 抑制LCSCs 自我更新能力

肿瘤球形成试验的结果表明： 不同浓度LY294002 处理LCSCs 的肺癌球形成数目显著降低，成浓度依赖性(表2)。

表2 LY294002 减少肺癌NCI-NCI-H446 细胞系肺癌球形成细胞的肺癌球数目(Mean±SD, n=3)

3 讨论

小细胞肺癌是一种具有很强侵袭性和高转移性的肺癌，约占肺癌病例总数的20%～25%[1]。此外，小细胞肺癌一般是顽固性的， 治疗后极易复发，这导致其预后极差[1]。 Eramo 等[4]在2007年首次报道了肺癌CSCs 属于CD133+细胞亚群, 此类CSC 具有球体形成能力, 在免疫缺陷小鼠皮下植入1×104个细胞即能够形成肿瘤。然而，一些证据表明：利用CD133 表达的能力区分肺癌干细胞可能被夸大。例如， 一些CD133 阴性肺癌细胞也具有自我更新能力[5]。 另一种用于鉴别和分选肺癌干细胞的方法是基于醛脱氢酶活性。 从NCI-H358 和NCI-H125 肺癌细胞系分离的ALDH+多数为高致瘤性的CD133+细胞。 更为重要的是在有限的研究中ALDH1 蛋白表达与病人预后差相关[6]。 然而，还需要进一步的研究确定这些标志物作为假定肺癌干细胞标志物的前景和实用性。恶性实体肿瘤组织中的癌细胞源自上皮细胞，多数呈贴壁生长，阻止贴壁后癌细胞迅速凋亡，称为失巢凋亡(anoikis)。人们利用CSC 具有anoikis 抗性， 能在无血清培养条件下， 经EGF、FGF 等细胞生长因子诱导形成悬浮生长的细胞球体的方法分离和富集CSCs, 例如脑瘤、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌和黑素瘤的CSC均具有球体形成能力[7]。耿沁等[3]从人非小细胞肺癌细胞系通过干细胞条件培养基悬浮培养法得到肺球体细胞中肺癌干细胞高度富集并具有致瘤性。在本文的研究中，我们以干细胞条件培养基，在超低粘附6 孔细胞培养板中得到的肺球体形成细胞亦具有自我更新特性和高致瘤性。说明源自人小细胞肺癌NCI-H446 细胞系肺球体形成细胞具有LCSCs 特性。

Singh 等利用DNA 染料Hoechst 33342 排除法从非小细胞肺癌细胞系分选得到侧群(SP)细胞具有LCSCs 特性， 同时发现SP 细胞较non-SP 细胞更高表达Akt 磷酸化蛋白， 提示：Akt 组成性激活对于维持LCSCs 特性可能有重要意义[2]。 我们采用Wester blot 分析的结果也证实，与亲本细胞系细胞相比，源自人小细胞肺癌NCI-H446 细胞系肺球体形成细胞高表达Akt 磷酸化蛋白。说明来自小细胞肺癌的LCSLCs 具有Akt 组成性活化的信号途径特征， 暗示Akt 组成性活化在维持小细胞肺癌LCSLCs 自我更新中发挥重要作用。

为了证明Akt 组成性活化在维持小细胞肺癌LCSLCs 自我更新中发挥重要作用，我们用不同浓度Akt 活性特异性抑制剂LY294002 处理源自人小细胞肺癌NCI-H446 细胞系肺球体形成细胞观察Akt蛋白磷酸化水平和自我更新能力的变化。 正如预期的那样，研究结果表明：LY294002 在降低源自人小细胞肺癌NCI-H446 细胞系肺球体形成细胞Akt 蛋白磷酸化水平的同时， 以剂量依赖方式抑制肺癌球形成能力。 从而证实LY294002 具有抑制来自小细胞肺癌的LCSLCs 自我更性作用。 因此，突出了靶向抑制小细胞肺癌LCSCs 中组成性激活Akt 信号传导是一种抑制小细胞肺癌LCSCs 自我更新功能发挥治疗小细胞肺癌的新策略的科学意义。

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