陕西地区荷斯坦牛Mx1基因外显子多态性分析

王风巧，党瑞华，黄洁萍，雷初朝，蓝贤勇，陈 宏

（西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌712100）

Mx（myxovirμs resistance）基因是由 Lindenmann等［1］在一近交小鼠品系A2G小鼠中首次发现，因其能耐受对其它随机交配小白鼠致死剂量的流感病毒感染而命名为Mx基因。Mx蛋白是一种由Ⅰ型（α／β）和Ⅲ型（λ）干扰素诱导产生具有 GTPase活性的抗病毒蛋白［2］。大多数脊椎动物体内有1～3个Mx蛋白的不同异构体，一般定位于核内或胞质中。

Mx蛋白可在多种动物的多种类型细胞中表达，对多种病毒具有抗性［3］。Mx蛋白已知对RNA病毒，如流感病毒、水疱性口炎病毒、托高土病毒和汉坦病毒等有抑制作用，甚至对DNA病毒也有一定的抑制作用，如乙型肝炎病毒［4］。RNA病毒的感染可以使牛Mx基因的m RNA和Mx蛋白质表达水平上升［5］。所以，机体内Mx蛋白表达水平的上升，也可作为机体感染病毒的特殊信号。与干扰素相比，Mx蛋白具有活性稳定、特异性好、半衰期长、检测方便以及抗病毒作用更直接的优点。因此，对Mx基因及其编码蛋白的研究和开发将有助于未来畜禽病毒感染状况检测及抗病育种工作。

牛的Mx1基因位于1号染色体上，含有15个外显子，编码648个氨基酸。目前关于牛Mx1基因多态性及抗病毒活性的研究主要集中在国外具有代表性的牛品种上，Mx1基因还包含2个剪接亚型Mx1B［6］和 Mx1a［7-8］。Nakatsu等［9］在5个代表性牛品种的Mx1 c DNAs中发现了11个SNPs，构建了11种主要单倍型，并在3＇-UTR发现一个13 bp的片段插入／缺失突变。另外，通过体外重组感染试验证明，牛Mx1基因具有抗传染性水疱性口炎病毒（SVS）的活性，且不同的单碱基突变对病毒抗性有不同的影响。目前，对此基因新功能的挖掘尚在不断研究中，例如是否和奶牛的乳房炎抗性相关等。本试验旨在通过分析陕西地区荷斯坦牛Mx1基因的多态性，为下一步调查其多态性与体细胞数的关联性奠定基础，也为将来Mx1基因在奶牛抗病育种中的应用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究从西安市农业总公司牛一场采集226头荷斯坦牛的毛发样，从杨凌晟元荷斯坦牛场采集120头荷斯坦牛的血样，共346个荷斯坦牛样品。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 血样DNA的提取采用常规的酚-氯仿法。毛发DNA提取步骤如下：①用灭菌镊子取3～5根毛发，先将毛囊及毛干浸入75%的酒精清洗后，再用蒸馏水冲洗，避免所有潜在的污染，然后将清洗好带毛囊的毛发，剪取5～8 mm带毛囊的毛干放入200μL无菌离心管；②每个离心管中各加入100μL毛发裂解液和0.5μL蛋白酶K（20 mgom L-1）；③将离心管放入PCR仪中处理，PCR程序为：58℃30 min，75℃15 min，4℃5 min。提取好的DNA分装后贮存在-20℃，以备DNA检测、OD值检测和PCR扩增。毛发裂解液配制如下：250μL Tween20，5 m L 10×PCR buffer，5 m L MgCl2（25 m M），20μL CaCl2（10 m M），最后加蒸馏水至50 m L。

1.2.2 引物设计和PCR扩增 根据NCBI（Gen-Bank登录号：NW-003103824）提供的牛Mx1基因序列，采用引物设计软件Primer 5.0设计，由生工生物工程（上海）有限公司合成。共设计15对引物（见表1）。

荷斯坦牛混合DNA池（每10个不同样本混合成一个DNA池）为模板，进行Mx1基因的PCR扩增。PCR扩增总体积为36μL：1.5μL混合DNA池模 板 （10 ng／μL）、1.5μL 引 物 （10μmol／L）、18.75μL 2×Taq Master Mix（2×PCR缓冲液，3 m M MgCl2，1 U Taq DNA聚合酶和400μM d NTP混合物）、14.25μL dd H2O。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火（退火温度见表1）40 s，72℃延伸40 s，35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序。

表1 牛Mx1基因的引物信息Table 1 The information of primer sequences in bovine Mx1 gene

1.2.3 PCR-RFLP分析 利用DNA Star软件对PCR产物测序结果进行比对分析，筛选出SNPs位点，再采用PCR-RFLP方法对346头荷斯坦奶牛的SNPs位点进行基因分型。酶切体系包括：5μLPCR产物、9μL dd H2O、1μL buffer缓冲液、0.5μL（10 U／μL）限制性内切酶，最适温度消化过夜。酶切产物用3%的琼脂糖凝胶电泳或者8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，再通过凝胶成像系统观察并记录分型结果。

表2 PCR-RFLP引物及条件Table 2 PCR-RFLP primers and conditons

1.2.4 数据分析 利用DNASTAR Lasergene软件校对测序产物的原始序列；利用Clustal X软件进行序列比对；利用SHEsis在线软件计算基因频率和基因型频率，并进行单倍型及频率统计。

2 结果与分析

本研究对陕西地区荷斯坦牛Mx1基因的14个外显子进行了多态性分析，共发现4个SNPs，均为转换，分别是外显子3（g.843330 T＞C，g.843411 A＞G）、外显子4（g.844048 C＞T）和外显子7（g.851325 T＞C）。其中，外显子3（g.843330 T＞C，g.843411 A＞G）和外显子7（g.851325 T＞C）3个位点是错义突变，外显子4（g.844048C＞T）位点是同义突变。氨基酸突变情况如表3所示。

4个SNPs位点依次选用限制性内切酶HincII、AvaI、Scr FI和HaeIII进行酶切分型。其中，外显子3（g.843411 A＞G）、外显子4（g.844048 C＞T）和外显子7（g.851325 T＞C）三个位点为天然酶切位点，外显子3（g.843330 T＞C）位点为创造性酶切位点。图（1-2）仅显示了外显子3（g.843411 A＞G）和外显子7（g.851325 T＞C）2个SNPs位点及其酶切分型多态性。4种酶切位点的分型统计结果见表4。4个突变位点都存在三种基因型，但纯合子的突变频率较低。各个突变位点的基因型及其频率如表5所示。4个SNPs位点共构建了11种（H 1-H 11）单倍型（见表6），其中H 6为最主要的单倍型，频率为0.362，H 4和H 7次之，其频率分别为0.176和0.354。

表3 牛Mx1基因的氨基酸突变Table 3 The mutation of amino acid in bovine Mx1 gene

3 讨 论

Mx基因不仅存在于脊椎动物中，在非脊椎动物鲍鱼中也存在［10］，说明Mx基因广泛存在于各种动物体内，对机体生存具有重要作用。在畜禽抗病育种实践中，Mx蛋白和主要组织相容性复合体因具有抗病毒作用而备受抗病育种研究者的关注，在猪、禽群体中已广泛调查了其多态性。张爱玲等［11］在猪Mx l基因内含子1及外显子2中发现了8个SNPs；Takeya等［12］在猪的Mx1基因第14外显子中发现了3个SNPs；Ko等［13-14］发现鸡2032位点的单核苷酸突变导致丝氨酸突变为天冬氨酸，此时的Mx1蛋白才具有抗病毒活性。

表4 牛Mx1基因PCR-RFLP多态性Table 4 The PCR-RFLP polymorphism of bovine Mx1 gene

图1 Mx1基因外显子3（g.843411 A＞G）处SNP检测和扩增产物Ava I PCR-RFLP电泳分析M.50 bp Ladder；1，4.GG基因型；2.AG基因型；3.AA基因型Fig.1 The SNP detection and electrophoretic patterns of PCR products in exon 3（g.843411 A＞G）ofMx1 gene digested by Ava I endonucleaseM.50 bp Ladder；lanes1，4.GG genotype；lane 2.AG genotype；lane 3.AA genotype

图2 Mx1基因外显子7（g.851325 T＞C）处SNP检测和Hae III PCR-RFLP电泳分析M.50 bp Ladder；1.CT基因型；2，3.TT基因型；4.CC基因型Fig.2 The SNP detection and electrophoretic patterns of PCR products in exon 7（g.851325 T＞C）ofMx1 gene digested by Hae III endonucleaseM.50bp Ladder；1.CT genotype；2，3.TT genotype；4.CC genotype

表5 牛Mx1基因的基因型及其频率Table 5 Genotypes and genotype frequencies in bovine Mx1 gene

表6 牛Mx1基因的单倍型及其频率Table 6 Haplotypes and haplotype frequencies in bovine Mx1 gene

在牛Mx基因研究上，目前相关报道较少，仅限于在国外牛品种中进行的多态性调查及与传染性水疱性口炎病毒的抗性相关研究。Nakatsu等［9］在5个代表性牛品种的Mx1 cDNAs中发现了11个SNPs，其中10个同义突变，1个导致异亮氨酸（Ile）替换为甲硫氨酸（Met）的错义突变。此外，在3＇-UTR还发现了一个13 bp的片段插入／缺失突变。Babiker等［15］在11个牛品种的Mx2 cDNAs中发现了17个SNPs，其中14个同义突变，2个引起甘氨酸（Gly）替换为丝氨酸（Ser）、异亮氨酸（Ile）替换为缬氨酸（Val）的错义突变，还有1个SNP位于3＇-UTR区。另外，Babiker等在水牛上也发现了46个SNPs，其中34个是同义突变，12个SNPs引起了氨基酸的替换。在水牛Mx2基因5＇-UTR区还发现一个9 bp的片段插入／缺失突变。本试验结果也表明在荷斯坦奶牛群体中，Mx1基因具有较丰富的多态性。Nakatsu等［9］和Babiker等［15］通过体外重组试验证明Mx1和Mx2基因具有很好的抗传染性水疱性口炎病毒（VSV）的活性，且不同的单核苷酸突变和片段插入缺失突变对其抗病活性有不同的影响。本研究在346头陕西地区荷斯坦奶牛Mx1基因的14个外显子中共发现了4个SNPs。其中，外显子4（g.844048 C＞T）是同义突变；外显子3（g.843330 T＞C，g.843411 A＞G）两个位点的突变分别引起了异亮氨酸（Ile）向苏氨酸（Thr）和谷氨酸（Glu）向精氨酸（Arg）的突变；外显子7（g.851325 T＞C）位点的突变导致亮氨酸（Leu）向脯氨酸（Pro）的突变。氨基酸序列的改变将导致最终编码蛋白构象的变化，也意味着不同基因型个体在抗病毒活性方面可能存在差异，这些多态位点将是未来奶牛抗病育种选育需要关注的地方。本研究所发现的SNPs数量少于Nakatsu等［9］的发现，可能原因是因为本研究只选取了陕西地区荷斯坦奶牛的群体，品种单一，规模也较小，另外也只调查了编码氨基酸的外显子序列。本研究首次对陕西地区荷斯坦奶牛Mx1基因的14个外显子进行了多态性分析，发现其多态性较丰富，这将有利于下一步调查其与奶牛体细胞数的关联性，也将为未来荷斯坦奶牛抗病育种实践提供基础数据。

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