美洲大蠊不同提取部位的体外抑菌活性研究

李远辉，李希,，冯建安，武亚晓，吴莹

美洲大蠊(Periplaneta americanaL.) 为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，始载于《本草经》，味咸，性寒，有散瘀、化积、解毒等功效，主治癥瘕积聚、小儿疳积喉痹、乳蛾、痈疮肿毒、虫蛇咬伤等病症,是一种传统药用昆虫[1]。现代药理研究表明，美洲大蠊具有促进血管增生、组织修复，强心升压、改善微循环，抗菌抗炎、抗病毒、抗肿瘤，增强免疫等作用[2]。目前，对美洲大蠊的活性研究多集中在抗肿瘤，治疗肝炎、心血管疾病等方面[3]，但抑菌活性的相关研究文献报道较少。本研究通过体外抑菌实验，研究美洲大蠊不同提取部位对3种受试菌种(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌) 的体外抑菌活性，明确其最低抑菌浓度( MIC)和最低杀菌浓度(MBC),确定其抑菌活性部位，为进一步的抑菌活性成分研究提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验药物

美洲大蠊（湖南科伦制药有限公司提供，批号：130826)。

1.2 试剂

铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]中国药品生物制品检定所提供；MH 琼脂培养基(批号:110717)，MH 肉汤培养基(批号:120728) 成都生物制品检定所提供；DMSO（批号：870207，天津市化学试剂一厂）。

1.3 仪器

立式灭菌器(型号:YX280A，上海三申医疗器械有限公司），电子天平(型号: BT125D,德国Sartorius公司)，DNP-9162 电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 供试品溶液的制备 取美洲大蠊粗粉2000 g，用95%乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压旋蒸得95%乙醇浸膏900 g，留20 g用于配制95%乙醇提取部位供试品溶液。剩余乙醇浸膏用水混悬，采用系统溶剂萃取法分级萃取，用等体积的石油醚、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取并浓缩得石油醚浸膏，乙酸乙酯浸膏，正丁醇浸膏。分别取95%醇浸膏、石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏，用吐温-80溶解,制成每升含相当于800 g原生药的溶液, 用0.22 μm的无菌过滤器除菌后，作为供试品溶液，保存至4 ℃冰箱备用。

1.4.2 菌悬液的制备 将3种受试标准菌株分别接种于M-H琼脂培养基平板上，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。分别用无菌生理盐水将菌苔洗下并校正菌液浓度，使其相当于0.5麦氏比浊标准，再用M-H肉汤培养基分别稀释至含菌量约为1×106CFU．L-1，即为受试菌种的菌悬液，稀释后的菌悬液在15 min内接种。

1.4.3 体外抑菌实验 采用试管二倍稀释法联合琼脂平板法[4]。

1.4.4 供试药物的抑菌试验 取12支无菌小试管为一组，每支试管分别加入M-H肉汤培养基2 mL。取供试品溶液，用吸管吸取药液2 mL置第1管内，混匀后吸取2 mL置第2管内，同样混匀后吸出2 mL置第3管内。依此法逐管进行稀释至第12管。使各管药物浓度分别为400，200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0.39，0.195 g．L-1，各管均加入菌悬液0.1 mL。各供试品溶液按此法做3组平行实验。

1.4.5 对照实验 取5支无菌小试管为一组，分别标记“肉汤对照”、“溶剂对照”、“金黄色葡萄球菌对照”、“大肠埃希菌对照”、“铜绿假单胞菌对照”。除“肉汤对照”管外其余各管均加入M-H肉汤2 mL和相应菌悬液0.1 mL。做3组平行试验。

将以上所有试管于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后观察并记录实验结果。在各对照管符合要求的前提下，以肉眼未见生长的最低药物浓度为美洲大蠊各提取部位对受试菌种菌的MIC。再从未见细菌生长的试管中取1 mL于M-H琼脂培养基的琼脂平板上作次代培养，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后观察并记录实验结果，以不生长菌落的最低药物浓度为美洲大蠊各提取部位对受试菌种的MBC。

2 结果

2.1 供试药物的抑菌试验

美洲大蠊石油醚提取部位的抑菌活性最强，对三种受试菌种均有抑菌作用， MIC为1.56～6.25 g．L-1，MBC为1.56～12.5 g．L-1；美洲大蠊乙酸乙酯提取部位对铜绿假单胞菌有抑菌作用，MIC为25 g．L-1，MBC为50 g．L-1；而正丁醇提取部位及95%乙醇提取部位无明显抑菌作用。结果见表1。

2.2 对照实验

“肉汤对照”组无菌落长出,“溶剂对照”组对三种受试菌种无抑菌作用,“金黄色葡萄球菌对照”、”大肠埃希菌对照”、“铜绿假单胞菌对照”各标准菌株培养后菌落个数相当。各对照管符合要求。

3 讨论

抗生素投入临床使用以来，至今已有70多年的历史。随着全球抗生素的滥用，不断涌现的耐药菌甚至超级耐药菌使得细菌感染性疾病再次成为困扰人类的难题[6]。发掘新的抗耐药菌感染的抗菌药物成为人类重大课题。而在中药抗感染治疗中, 细菌对抗感染中药及其复方不易产生耐药性, 且部分中药具有延缓、消除耐药性的现象, 增加了对抗细菌耐药性的措施与策略[7]。本实验对美洲大蠊进行系统的体外抑菌活性研究，以期为开发中药抗菌药、攻克细菌耐药性的研究提供一条新思路。

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及铜绿假单胞菌在创面细菌性感染中占了很大比例[8～9]，致病性强同时又表现出多重耐药性，给临床后期治疗带来了很大的困难。故本研究选以上3种菌株作为抑菌活性筛选载体，能更好的评价美洲大蠊药材不同提取部位的抑菌活性。

本研究结果表明，美洲大蠊最有效抑菌部位为石油醚提取部位，提示美洲大蠊所含的抑菌活性成分在石油醚提取部位的分布较集中，可能为同一类化学成分，这为美洲大蠊进一步的抑菌活性成分研究提供了参考依据。目前被开发利用的主要为美洲大蠊药材的乙醇、水提取部位，如“康复新”、“心脉隆”、“肝龙胶囊”等系列药，若加大对美洲大蠊低极性部位的抑菌活性的研究开发，对于临床上治疗各种致病菌感染具有重要意义。

[1] 南京中药大学.中药大辞典,第2版[M].上海:上海科技出版社,2006:3784.

[2] 王奎,冯颖,孙龙,等.美洲大蠊乙酸乙酯提取物的分离和抑菌活性分析[J].林业科学研究,2013,26(2):164.

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