Wnt信号通路与肿瘤多药耐药性的研究进展

徐建梅，刘风玲，陈 浩

肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)最早被发现于血液系统的恶性肿瘤中，指肿瘤组织中存在的一小群具有自我更新和分化潜能的细胞或具有干细胞样能力的肿瘤细胞亚群，与肿瘤发生、发展、复发、转移、放疗和化疗的敏感性降低及耐药性密切相关[1]。近年来，人们对CSCs方面的研究不断取得突破，目前已发现CSCs中存在多种信号通路，如Wnt/β-catenin、Hedgehog、Notch、Bmi-1和BMP等，若出现突变和异常激活可导致肿瘤的发生。Wnt信号通路是一条研究较为清楚的信号通路，是一条多环节、多作用位点的开放式途径。

Wnt信号通路是高度复杂且和人类很多疾病相关联的通路，因为该通路主要作用于胚胎形成、人类组织修复，针对该通路的靶向药物并不会引起明显的毒副作用及毒性[2]。然而靶向Wnt信号通路的尝试并没有取得很大的成功，至今没有临床可批准的用药，这可能是由于Wnt信号通路下游基因药物的靶向选择问题[3]。很多研究已经报道恶性肿瘤中存在通路上游组成部分的灭活，包括SFRP和DKK家族成员，其扮演着肿瘤形成过程中看门蛋白的关键角色[4]，同时细胞外的蛋白由于其在通路中相对应的上游的位置，也可能成为药物靶点。本文将主要对Wnt信号通路在多种实体肿瘤中的最新研究进展进行阐述，深入探讨Wnt信号通路的作用机制，为逆转肿瘤多药耐药性提供新的研究方向。

1 Wnt信号通路的概况

Wnt是一种富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，通过旁分泌或自分泌在发育过程中调控增殖，发挥促进因子的作用。Wnt信号通路主要由以下几种蛋白组成：Wnt蛋白、卷曲蛋白(frizzled，Frz)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP 5/6)、散乱蛋白(dishevelled，Dsh)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、结肠腺瘤性息肉病蛋白(APC)、酪蛋白激酶1(CK1)、轴蛋白(axin)、β-连环蛋白(β-catenin)、钙黏蛋白(E-cadherin)、T细胞因子/淋巴样增强因子(TCF/LEF)。Wnt蛋白与其细胞膜表面的Frz家族跨膜蛋白(Fz)受体结合后，其配体可以参与信号传导[5]，并可能激活细胞内的3条信号通路：(1)Wnt/β-catenin信号通路,此通路通过稳定核内β-catenin激活靶基因，其在胚胎发育和肿瘤中的功能已基本阐明；(2)Wnt/Ca2+信号通路,此通路由Wnt5α和Wnt11激活，引起细胞内Ca2+增加和Ca2+敏感信号成分的激活，如钙调蛋白依赖的激酶和激活T细胞核因子，该通路能拮抗经典的Wnt通路；(3)由c-Jun N端激酶(c-Jun N-tenninalkinase，JNK)介导的细胞极性信号通路(planar cellpolarity，PCP)，该途径涉及RhoA和Jun激酶(JNK)，调控细胞骨架的重排，其主要作用是对胚胎发育的阶段性调控[6]。

已知Wnt信号通路在胚胎细胞发育、增殖、转化、细胞黏附、细胞存活和凋亡方面有重要作用。通常，Wnt信号通路可以通过Wnt配体的过表达而直接被激活，或者通过Wnt信号的下游组件突变的传递作用而被激活。目前，研究较多且机制较为清楚的是经典Wnt信号通路，此信号通路发挥生物学效应是通过Wnt与细胞外基质分子紧密相连，并与相应受体结合而实现的。当Wnt信号缺失时，β-catenin与轴蛋白、APC、GSK-3β 组成的多蛋白复合体结合后被磷酸化，进而泛素化被降解，使细胞质β-catenin保持在较低水平。其中，GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对于破坏复合体起关键作用。当Wnt信号通路启动后，Wnt配体与细胞膜表面的Fz/肺耐药相关蛋白受体结合阻断了GSK-3β介导的β-catenin的磷酸化，即从轴蛋白/APC、GSK-3β组成的降解复合物分离，导致细胞质中β-catenin的稳定和积聚，随后进入细胞核，在核内与TCF/白细胞移动增强因子结合，削弱TCF/白细胞移动增强因子蛋白与转录抑制因子Groucho结合所引起的抑制作用，从而调节下游靶基因C-myc、Cyclin D1、环氧酶2(COX-2)、基质金属蛋白酶(MMP)的表达[7]，而这些靶基因在肿瘤的生长、侵袭、血管生成和转移中起重要作用。

近年来的研究表明，Wnt/β-catenin信号通路的不恰当激活，参与了肿瘤的发生及其侵袭转移过程，而且还与CSCs的关系密切[8]。正常情况下机体内该途径处于静默状态，几乎没有Wnt信号。但在恶性肿瘤发生过程中，Wnt/β-catenin信号通路突变性激活，导致其关键性标志蛋白β-catenin异常累积，进入细胞核内激活Wnt/β-catenin信号通路靶基因的转录，改变细胞迁移能力和细胞极性，从而诱导肿瘤发生。

2 Wnt信号通路在肿瘤耐药性中的研究进展

2.1 Wnt信号通路与乳腺癌 在正常的乳腺细胞中，Wnt信号通路相关蛋白的表达受到一定的限制，而在乳腺癌细胞中其表达增高，提示Wnt信号通路对于维持乳腺癌干细胞的自我更新、胚胎时期的分化及成体发育有重要的作用[9]。沙利霉素(salinomycin)是第一个被报道的选择性作用于乳腺癌干细胞的抑制剂[10]，对乳腺癌干细胞的杀伤效果要比传统化疗药物紫杉醇高约100倍，但对正常干细胞相对无毒性。最近的研究表明沙利霉素的作用机制在于抑制了Wnt信号通路的活性，其阻滞了Wnt共受体LRP6的磷酰化过程，并诱导LRP6分解。

他莫昔芬增加了ER阳性乳腺癌患者的生存率，但随着获得性耐药的发展，其长期获益是有限的。最近的Meta分析显示应用他莫昔芬辅助内分泌治疗5年会产生33%的远处复发及转移[11-12]，而已经被确认与他莫西芬耐药产生有重要相关性的一条通路是Wnt信号通路[3]。Loh等[13]最近进行了一项关于他莫西芬耐药乳腺癌细胞(TamR)的实验，结果显示TamR细胞在给予他莫西芬时，其Wnt靶基因、轴蛋白2以及非经典Wnt受体Ror2表达增加。人重组Wnt3a可明显增加TamR Wnt荧光素酶受体的转录水平，但对亲代MCF7细胞却没有作用，而且相比单独给予他莫西芬，联合应用人重组Wnt3a及他莫西芬可以抑制MCF7及TamR的增殖。进一步说，人重组Wnt3a对TamR的治疗可增强对他莫西芬的耐药性，使其回到接近基础水平。在TamR中，给予Wnt抑制剂IWP-2可以增强他莫西芬抗增殖的效果。这项研究表明靶向Wnt信号通路的药物可能为耐药性乳腺癌的个体化及靶向治疗开启新的前景。

2.2 Wnt信号通路与胃癌 国内研究者官文华等[14]通过研究发现，在胃癌组织中Wnt3、Wnt3a及β-catenin的表达量明显增高，提示Wnt/β-catenin信号通路在胃癌中处于活化状态,且Wnt3、Wnt3a可能在启动胃癌Wnt信号通路的活化过程中起到了主要作用。研究同时发现Wnt3a的高表达与胃癌患者的年龄、淋巴结转移及TNM分期相关,说明其参与了胃癌的发展过程,并且与胃癌转移及出现耐药具有相关性。由此，研究者推测这可能与胃癌中高表达的Wnt3a激活Wnt信号通路导致大量β-catenin在细胞质中累积有关。正常细胞中无Wnt信号时,细胞质内β-catenin大部分与细胞膜上E-cadherin结合形成黏着复合体,介导同型细胞间的黏附,对维持上皮形态结构的完整性和细胞极性起重要作用[15]，在癌组织中可能存在黏着复合体异常表达,使癌细胞丧失极性,具备侵袭性。

幽门螺杆菌(H.pylori)感染是胃癌发生的主要生物学因素，胃癌可能是H.pylori和其他多种因素共同作用的结果。最近研究表明H.pylori感染可以激活Wnt/β-catenin和COX-2/E2信号通路，这两种信号通路在胃癌的发生中发挥关键性作用,研究证实H.pylori感染可以导致β-catenin和P120的表达，进而间接地在胃上皮细胞中表达过氧化酶增殖因子活化受体，使胃上皮细胞增殖，这些作用归因于cag分泌系统的底物cagA和肽聚糖，而cagA是H.pylori的细菌蛋白，在小鼠中可以独立产生胃癌[16]。同时Wnt信号通路的靶基因谷氨酰合成酶(GS)与H.pylori的关系也有相关研究，GS蛋白表达阳性率逐渐升高，H.pylori感染的阳性率也逐渐升高[17]。

异常的Wnt信号通路可以出现于46%以上的胃癌中，Wnt信号通路和干细胞表达标记物与患者的生存率低相关[18]。Bauer等[19]对480例经过含5氟尿嘧啶(5-FU)药物进行新辅助化疗的进展期胃癌患者进行研究，分析了经新辅助化疗后CSCs相关基因的表达情况，主要包括GSK-3β、β-catenin基因CTNNB1和Notch2。结果表明GSK-3β和CTNNB1表达水平高的患者有较高的生存率，同时发现在残余胃癌耐药细胞中GSK-3β和CTNNB1高表达，可以作为患者预后良好的标志物。以上研究可表明在胃癌的发生、发展、转移及耐药过程中Wnt信号通路及相关蛋白发挥重要作用，针对Wnt信号通路的治疗可能为胃癌的治疗提供新的思路，而且有可能成为判断病情进展及预后的指标。

2.3 Wnt信号通路与卵巢癌 Wnt信号通路中的β-catenin被磷酸化导致β-catenin/E-cadherin复合体解聚是E-cadherin表达水平和功能的主要调节方式，可使E-cadherin在细胞连接处密度降低，失去接触抑制功能，易发生细胞离散，引起肿瘤的浸润、转移。β-catenin通过介导卵巢细胞增殖及卵巢细胞抗凋亡基因的表达，引起卵巢癌的发生、发展。现认为β-catenin介导的Wnt信号通路异常导致卵巢癌发生是早期事件，而其参与β-catenin/E-cadherin复合体功能异常引起卵巢癌细胞浸润转移是晚期事件。

最近人们对上皮源性卵巢癌进行研究，给予卵巢癌患者系统性的治疗(紫杉醇、卡铂[20])，并且对相关分子通路进行研究，从而寻找出异常的肿瘤标记物并进行干预治疗，被认为在卵巢癌中有潜在重要性的是Wnt信号通路[21-23]。分泌型卷曲相关蛋白家族(SFRPs)是分泌Fz受体蛋白的家族成员，在恶性程度较高的卵巢癌中发生突变，是看门基因之一[24]，而且相对于表达SFRP4的患者来说，缺失此基因预后更差，更易发生转移及耐药[24]。因为SFRP4表达缺失发生于大部分卵巢癌患者中[24]，通过SFRP4或Wnt信号通路的其他上游成员进而调控Wnt信号通路可能代表了卵巢癌靶向治疗的新思路。

Ford等[25]对SFRP4进行实验，研究中应用血清卵巢癌细胞系OVCAR3，应用重组人SFRP4(5 μg/L)对该细胞系进行治疗，48 h后SFRP4 mRNA及相关蛋白增加大约2倍，而细胞外的重组人Wnt蛋白的增加也加强了内源性蛋白的产生。然而，随着重组人SFRP4的治疗，Wnt下游的靶基因Cyclin D1、C-myc和轴蛋白2表达减少。同时，该实验证明应用重组人SFRP4进行治疗对细胞增殖并没有效果，但却明显抑制OVCAR3细胞转移侵袭的能力，也表明增加SFRP4可以增强卵巢癌细胞对胶原及纤维覆盖组织的黏附力。

2.4 Wnt信号通路与肝癌 乙型肝炎病毒(HBV)是肝细胞性肝癌发生的重要原因之一，病毒性肝炎向肝癌进展过程中Wnt/β-catenin信号通路起着关键的作用。最新研究报道显示，HBV编码的乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)可以在胞质内与APC竞争性结合，进而影响APC与β-catenin形成破坏复合体，导致β-catenin在胞质内不能被泛素化降解，从而转位入核，诱导肝细胞恶性转化[26]。

已有研究表明，肝细胞癌(HCC)标本中β-catenin蛋白异质表达程度与患者淋巴结转移及肝内转移呈正相关[27]。Noda等[28]通过实验研究发现Wnt/β-catenin激活可以增强肝癌细胞对干扰素(INF)/5-FU的耐药性，究其原因可能是降低这些药物对体内肿瘤细胞DNA合成及调控的抑制作用。

2.5 Wnt信号通路与结肠癌 结肠癌的发生、发展与Wnt信号通路的异常也存在一定的关系，研究发现趋化因子基质细胞衍生因子1(SDF-1)可以诱发磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)的磷酸化作用，促进β-catenin中酪氨酸的磷酸化，使E-cadherin/β-catenin复合体数目减少，细胞间的黏附减少，促进了肿瘤的迁徙能力[29]。Wu 等[30]发现Nur77也是β-catenin下游因子：β-catenin激活和转录AP-1，生成的AP-1则可以与Nur77的前体结合，继而激活Nur77，使其表达升高，升高的Nur77又可以进一步诱导上调抗凋亡因子BRE和VEGF表达，促进细胞的增殖，加速细胞形成集落，并增强细胞的迁徙能力。

目前，药物及食物抑制Wnt信号通路相关过程的研究取得了很大的进展。研究发现，苏灵大既可以减少β-catenin蛋白的表达，又可以抑制β-catenin蛋白从胞质到细胞核的移位，从而降低细胞核内β-catenin/TCF转录复合体数量及其下游因子S100A4蛋白的表达，最终使结肠癌细胞的侵袭性及移动性下降[31]。食物中的维生素D及其衍生物1，25二羟维生素D3〔1,25-(OH)2D3〕可以通过与维生素D受体结合，最终抑制β-catenin的活性及其转录基因DKK4的表达，上调DKK1的表达，进一步研究发现，DDK4在结直肠癌中表达上升，可以增加肿瘤细胞的移动能力和侵袭性；DDK1则是Wnt/β-catenin信号通路的抑制因子，其表达上升可以抑制细胞的增殖、转移[32]。

3 展望

由于干细胞理论的不断成熟，CSCs理论的进一步完善，CSCs与肿瘤的发生、复发、耐药性密切相关，多条信号通路在CSCs自我更新中的重要作用已被证实，然而其具体机制仍不很明确，信号通路之间如何交互作用最终影响CSCs行为的机制不很清楚。Wnt信号通路作为一条最早调控胚胎发育及决定细胞命运的古老传导通路，在肿瘤发生、侵袭及转移中的调控作用机制越来越被人们所认识，调控的机制随研究的深入而变得逐渐清晰,但是与细胞增殖、分化及凋亡的信号通路还有许多，Wnt信号通路与其他信号通路之间存在许多交叉，Wnt信号通路在其中究竟是起主导作用，还是与其他信号通路协同发挥作用，或者只是起到一些辅助性的作用。将靶向CSCs内信号通路的治疗方法与传统的放化疗方法以及RNA干扰、免疫疫苗等新兴的抗肿瘤技术联合运用，必将为逆转肿瘤多药耐药性治疗翻开崭新的篇章。

1 Song J,Chang I,Chen Z,et al.Characterization of side populations in HNSCC:highly invasive,chemoresistant and abnormal Wnt signaling[J].PLoS One,2010,5(7):e11456.

2 Takebe N,Harris PJ,Warren RQ,et al.Targeting cancer stem cells by inhibiting Wnt,Notch,and Hedgehog pathways[J].Nat Rev Clin Oncol,2011,8(2):97-106.

3 Clevers H,Nusse R.Wnt/β-catenin signaling and disease[J].Cell,2012,149(6):1192-1205.

4 Veeck J,Dahl E.Targeting the Wnt pathway in cancer:the emerging role of Dickkopf-3[J].Biochim Biophys Acta,2012,1825(1):18-28.

5 Zhao RC，Zhu YS，Shi Y.New hope for cancer treatment:exploring the distinction between normal adult stem cells and cancer stem cells[J].Pharmacol Ther，2008,119(1):74-82.

6 Teng Y，Wang X，Wang Y，et al.Wnt / beta-catenin signalig regulates cancer stem cells in lung cancer A549 cells [J].Biochem Biophys Res Commun，2010，392(3):373-379.

7 Xu HT，Wei Q，Liu Y，et al.Overexpression of axin downregulates TCF-4 and inhibits the development of lung cancer[J].Ann Surg Oncol,2007,14(11):3251-3259.

8 Gaston-Massuet C,Andoniadou CL,Signore M,et al.Increased Wingless(Wnt) signaling in pituitary progenitor/stem cells gives rise to pituitary tumors in mice and humans[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(28):11482-11487.

9 Prospen JR,Goss KH.A Wnt-ow of opportunity:targeting the Wnt/beta-catenin pathway in breast cancer[J].Curr Drug Target,2010,11(9):1074-1088.

10 Lu D,Carson DA.Inhibition of Wnt signaling and cancer stem cells[J].Oncotarget,2011,2(8):587.

11 Kiely B,Stockler M.ACP Journal Club.Meta-analysis:adjuvant tamoxifen reduces recurrence and death at 15 years in ER-posotive early breast cancer[J].Ann Intern Med,2012,156(6):JC3-4.

12 Umar A,Kang H,Timmermans AM,et al.Identification of a putative protein profile associated with tamoxifen therapy resistance in breast cancer[J].Mol Cell Proteomics,2009,8(6):1278-1294.

13 Loh YN,Heddith EL,Baker LA,et al.The Wnt signalling pathway is upregulated in an in vitro model of acquired tamoxifen resistant breast cancer[J].BMC Cancer,2013,13:174.

14 官文华，杨堃，赵文君,等.Wnt3、Wnt3a在胃癌组织中的表达及意义[J].世界华人消化杂志,2013，21(7):624-628.

15 Tian X,Liu Z,Niu B,et al.E-cadherin/β-catenin complex and the epithelial barrier[J].J Biomed Biotechnol,2011,2011:567305.

16 Nagy TA,Wroblewski LE,Wang D,et al.β-Catenin and p120 mediate PPARδ-depedent proliferation induced by Helicobacter pylori in human and rodent epithelia[J].Gastroenterology,2011,141(2):553-564.

17 李雪，耿长新，于建宪，等.Wnt信号通路靶向基因GS蛋白与胃癌发生发展的关系[J].齐鲁医学杂志,2011,26(5):384-386.

18 Ooi CH,Ivanova T,Wu J,et al.Oncogenic pathway combinations predict clinical prognosis in gastric cancer[J].PLoS Genet,2009,5(10):e1000676.

19 Bauer L,Langer R,Becker K,et al.Expression profiling of stem cell-related genes inneoadjuvant-treated gastric cancer:a NOTCH2,GSK-3β and β-catenin gene signature predicts survival[J].PLoS One,2012,7(9):e44566.

20 Hiss D.Optimizing molecular-targeted therapies in ovarian cancer:the renewed surge of interest in ovarian cancer biomarkers and cell signaling pathways[J].J Oncol,2012,2012:737981.

21 Barbolina MV,Burkhalter RJ,Stack MS.Diverse mechanisms for activation of Wnt signalling in the ovarian tumour microenvironment[J].Biochem J,2011,437(1):1-12.

22 Schmid S,Bieber M,Zhang F,et al.Wnt and hedgehog gene pathway expression in serous ovarian cancer[J].Int J Gynecol Cancer,2011,21(6):975-980.

23 Yoshioka S,King ML,Ran S，et al.WNT7A regulates tumor growth and progression in ovarian cancer through the WNT/β-catenin pathway[J].Mol Cancer Res,2012,10(3):469-482.

24 Jacob F,Ukegijni K,Nixdorf S，et al.Loss of secreted frizzled-related protein 4 correlates with an aggressive phenotype and predicts poor outcome in ovarian cancer patients[J].PLoS One,2012,7(2):e31885.

25 Ford CE,Jary E,Ma SS,et al.The Wnt gatekeeper SFRP4 modulates EMT,cell migration and downstream Wnt signalling in serous ovarian cancer cells[J].PLoS One,2013,8(1):e54362.

26 Hsieh A,Kim HS,Lim SO,et al.Hepatitis B viral X protein interacts with tumor suppressor adenomatous polyposis coli to activate Wnt/β-catenin signaling[J].Cancer Lett,2011,300(2):162-172.

27 Cheng H,Liang H,Qin Y,et al.Nuclear beta-catenin overexpression in metastatic sentinel lymph node is associated with synchronous liver metastasis in colorectal cancer[J].Diagn Pathol,2011,6:109.

28 Noda T,Nagano H,Takemasa I，et al.Activation of Wnt/beta-catenin signalling pathway induces chemoresistance to interferon-alpha/5-fluorouracil combination therapy for hepatocellular carcinoma[J].British J Cancer,2009,100(10):1647-1658.

29 Wang L,Li CL,Wang L,et al.Influence of CXCR4/SDF-1 axis on E-cadherin/β-catenin complex expression in HT29 colon cancer cells[J].World J Gastroenterol,2011,17(5):625-632.

30 Wu H,Lin Y,Li W,et al.Regulation of Nur77 expression by β-catenin and its mitogenic effect in colon cancer cells[J].FASEB J,2011,25(1):192-205.

31 Stein U,Arlt F,Smith J,et al.Intervening in β-catenin signaling by sulindac inhibits S100A4-dependent colon cancer metastasis[J].Neoplasia,2011,13(2):131-144.

32 Egan JB,Thompson PA,Vitanov MV.Vitamin D receptor ligands,adenomatous polyposis coli,and vitamin D receptor FokⅠ polymorphism collectively modulate beta-catenin activity in colon cancer cells[J].Mol Carcing,2010,49(4):337-352.

文献来源：应用PubMed及中国知网(CNKI)期刊全文数据库检索系统，以“Wnt信号通路、干细胞、肿瘤多药耐药性、Wnt signaling、stem cells、tumor multi-drug resistance”等为关键词，检索1991年1月—2013年5月的相关文献，共检索到中文文献3 950条，英文文献650条。纳入标准：(1)Wnt信号通路的描述；(2)Wnt信号通路与肿瘤干细胞的相关研究；(3)肿瘤干细胞与常见肿瘤耐药性的关系；(4)Wnt信号通路与常见肿瘤耐药性的关系；(5)逆转肿瘤耐药性的研究进展。根据纳入标准分析，符合的文献共49条，选择时间和研究比较新的文献33条。