大鼠远端肺动脉平滑肌细胞原代培养及其生物学特性和功能的研究

廖运学，王昌明，蒋 明，马礼兵，徐 青，陈 峰，吕 倩

血管性疾病逐渐成为国内外研究的热点，血管平滑肌细胞(VSMCs) 的增殖和迁移是血管性疾病的重要病理改变[1]。慢性阻塞性肺疾病(COPD)的全身、局部炎症及缺氧等因素均可导致肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的增殖、凋亡及合成分泌功能改变，是COPD继发肺动脉高压的主要机制[2]。研究表明，肺动脉高压发生的主要部位在远端肺动脉[3]。目前原代培养大鼠 PASMCs的方法报道较多，国内也有相关大鼠 PASMCs原代培养及生物学特性与功能研究的报道[4-5]，但关于原代培养COPD模型大鼠远端 PASMCs及其功能的研究报道较少。本研究通过建立COPD大鼠模型，采用组织块贴壁法培养大鼠原代远端 PASMCs，探讨COPD大鼠与正常大鼠远端PASMCs生物学特性及功能的异同，为COPD继发肺动脉高压发病机制及药物防治研究提供更具有代表性的实验研究对象及研究数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠12只，8周龄,体质量(300±20)g，购自桂林医学院动物实验中心。

1.2 实验试剂 DMEM/F12培养基(GIBCO 公司 10×1 L)、胎牛血清(美国GIBCO)、0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液均为Hyclone公司细胞培养产品、青霉素-链霉素溶液(100×青-链霉素，含10 mU/L青霉素+10 g/L链霉素) 和 D′-Hanks 缓冲液(GIBCO)，二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司，翻盖红色金牌黄果树香烟(贵阳卷烟厂，焦油量15 mg，烟气烟碱量1.2 mg)，戊巴比妥钠注射液、75%乙醇用双蒸水(ddH2O)配制、经表面改性处理的25 cm2一次性细胞培养瓶；小鼠抗大鼠α- 平滑肌肌动蛋白抗体(美国abcam)、山羊抗小鼠 IgG(美国Earthox)，即用型链霉亲和素-生物素复合物(SABC)免疫组化染色试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒及磷酸盐缓冲液(PBS)均购于武汉博士德生物工程有限公司。CFDA SE细胞增殖与示踪检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.3 实验仪器 二氧化碳(CO2)培养箱(德国，Hereus)，倒置相差显微镜(日本，OLYMPUS)，荧光显微镜(日本，Olympus)，流式细胞仪(BD FACSAria Ш)。

1.4 动物模型的建立 大鼠适应环境1周后，按随机数字表法分为2组：(1) COPD模型组：于实验第1、14天经气道内注入脂多糖(LPS)溶液，200 μg/次，予自制有机玻璃舱内香烟烟雾暴露，舱内小孔与外界空气相通，保持舱内气压与外界相等，舱内放置无水氯化钙吸收水分、钠石灰吸收CO2，1 h/d，共 8 周。(2)对照组：第1、14天经气道内注入同等剂量0.9%氯化钠溶液，无香烟烟雾暴露，与COPD模型组同等条件下正常饲养。

1.5 组织块贴壁法分离、原代培养大鼠远端PASMCs 断颈法处死大鼠后浸泡于75%乙醇中 6 min，在超净工作台上开胸取出心肺组织，转移到含有100 U/ml青-链霉素的无菌 PBS的培养皿中，漂洗3次，迅速分离出肺动脉三级以下分支，剥净血管纤维层和外膜，更换培养皿，眼科剪纵行剖开肺动脉，内膜面向上，除掉内皮细胞层；在新的培养皿中加 4 ml含 25%胎牛血清DMEM培养液，将中膜组织剪成约2 mm3小块，再接种到一次性25 ml培养瓶，瓶内加入 4 ml事先配置好的含25%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml的DMEM培养液，翻转培养瓶，组织块贴在培养瓶底上，每块间距0.8～1.0 cm为宜。静置于37 ℃、5%CO2培养箱5～6 h，使小组织块贴紧瓶底；翻转培养瓶，让培养液覆盖于瓶底上的组织小块，置培养箱中静置培养，3 d 换1次培养液，4 d左右可见细胞从组织周围长出，呈长梭形或“鱼尾”状。

1.6 倒置相差显微镜下观察PASMCs形态及生长特点 细胞从组织块周围长出后，利用每次换液的时机在倒置相差显微镜下仔细观察PASMCs形态及生长特点并拍下。

1.7 细胞免疫组化染色 细胞爬片多聚甲醛固定后，石蜡切片脱蜡至水，3%过氧化氢室温5～10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次，抗原修复，滴加5%胎牛血清清蛋白(BSA)封闭液37 ℃ 30 min，滴加稀释的小鼠抗大鼠 α-SM-actin单克隆抗体(美国abcam，工作浓度1∶300)，孵育一抗，4 ℃过夜，PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min，共3次；孵育生物素化二抗山羊抗小鼠IgG(美国Earthox)，37 ℃ 30 min，PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min×3次；SABC法染色(即用型SABC免疫组化染色试剂盒)，37 ℃ DAB/过氧化氢(H2O2)显色。Mayor′s苏木素核固红复染，脱水透明，最后封片。显微镜下观察细胞并采图，胞质内肌动蛋白染成棕黄、肌丝与细胞长轴平行排列判定为阳性。

1.8 透射电镜鉴定 采用生长良好的第3代PASMCs，经消化离心吸弃上清液后，加入2.5%戊二醛固定液固定，置 4 ℃冰箱过夜后，按照电镜常规标本制作方法制成超薄切片，然后在透射电镜下观察其超微结构并拍照。

1.9 CCK-8检测各组细胞增殖情况 在96孔板中配置100 μl的PASMCs悬液，将培养板在培养箱预培养24 h(在37 ℃，5%CO2的条件下)，向培养板加入10 μl不同浓度的待测物质；将培养板在培养箱孵育24 h，然后每孔加入10 μl CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4 h，最后用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.10 细胞荧光流式细胞仪检测各组细胞增殖情况 取PASMCs 1×106/ml，在每一管中分别加入50 μl的组蛋白抗体(HAB)，并充分混匀，于室温中静置1 min以上，再直接加入软件连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应，孵育20～60 min后，用PBS(pH 7.2～7.4)洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

2 结果

2.1 细胞的光镜观察结果及生长特点 组织贴块、倒置干涸法培养PASMCs后的第4天即可见到细胞从组织块边缘萌出，呈游离状，游出细胞渐向外生长，成放射状排列。细胞形态呈梭形、鱼尾状，大小略有差异；生长不规则，对数生长期的PASMCs，早期单层生长融汇成片，细胞培养10 d后PASMCs层数增多重叠堆积形成“峰-谷”状(见图1)。

2.2 PASMCs的α-SM-actin免疫组化染色结果 染成棕黄色部分为PASMCs胞质，同时可看到肌丝与细胞纵轴成平行排列，细胞核经苏木素染色后呈淡蓝色，培养的原代细胞染色结果阳性率为97%以上(见图2)。

2.3 PASMCs透射电镜鉴定结果 透射电镜观察到PASMCs主要呈长梭形，亦呈不规则形，异染色质比较多，胞质内有与细胞纵轴平行的肌丝，大量胞饮，基膜下有少许密斑和密体，缺乏高尔基体，微丝管沿着胞核呈束状分布(见图3)。

2.4 两组吸光度比较 在细胞孵育时间相同的条件下，加入CCK-8后，COPD模型组PASMCs吸光度(1.079±0.119)高于对照组(0.871±0.041)，差异有统计学意义(t=4.039，P<0.05)。

2.5 两组细胞增殖结果 COPD模型组PASMCs增殖(1.315±0.203)强于对照组(1.023±0.057)，差异有统计学意义(t=3.387，P<0.05)。对照组PASMCs荧光增强(见图4)。

图2 PASMCs的α-SM-actin免疫组化染色结果(×200)

图3 PASMCs透射电镜鉴定结果(×15 000)

注：A 细胞呈梭形或鱼尾状从贴壁组织周围萌出，B 细胞呈对数生长，C 细胞部分融合交织成网状，D 细胞重叠生长成“峰-谷”状

图1 PASMCs光镜观察结果及生长特点(×100)

Figure1 Growth characteristics of cells by light microscopy observations

注：A COPD模型组PASMCs增殖增强、荧光减弱，B 对照组PASMCs增殖减弱、荧光增强

3 讨论

PASMCs是构成肺动脉的主要结构，具有增殖等功能。PASMCs的结构和功能是决定肺血管动力学的主要因素之一[6]。目前，对PASMCs的结构及其功能的研究日益受到重视。COPD是一常见病、多发病，但其发病机制较复杂。PASMCs的异常增殖和迁移是COPD继发肺动脉高压的基本病理生理学改变，并影响患者的预后及生活质量[7]。研究报道，COPD患者的肺动脉管壁增厚、管腔变窄，其结构与正常人不同[8]。目前，国内外关于原代培养大鼠 PASMCs方法的报道较多，但是，当前从细胞水平上对COPD患者与正常人的功能对比研究报道较少。本实验从动物模型体内提取PASMCs进行体外培养，并研究两者的生物学特性及功能差异。

目前普遍认为：长期显露于香烟烟雾环境下，易诱发COPD[9]；在慢性炎症或低氧条件下，PASMCs会出现增殖性改变，继而发生肺血管重塑，最终发生肺动脉高压[10]。本实验通过从COPD模型组及对照组大鼠中提取、原代培养出PASMCs，经细胞免疫组化染色及透射电镜等鉴定为实验所需的PASMCs，阳性率在97%以上。研究中发现，COPD模型组大鼠与对照组大鼠PASMCs用同种方法培养后在显微镜下观察，组织贴壁后都呈放射性生长或似“火山爆发”样，长出细胞呈长棱形或“鱼尾”状，细胞多层重叠后高低起伏似“峰-谷”状，一般都是在组织贴壁后3～4 d开始长出细胞，与国内相关文献报道的关于PASMCs原代培养生长特性相似，说明两者形态及生长特性无差异；增殖与示踪检测PASMCs的生长曲线发现，COPD模型组PASMCs增殖高于对照组，表明COPD组PASMCs与对照组功能不同。

原代细胞培养是一件较难、较复杂的实验，本实验采用从COPD模型大鼠体内取出组织进行体外原代细胞培养，并取得成功，对照组与COPD模型组原代培养的PASMCs形态学相似，但生物学特性不同，功能亦存在差异，原代培养肺动脉平滑肌细胞可为COPD继发肺动脉高压发病机制及药物防治研究提供更具有代表性的实验研究对象及研究数据。同时发现组织贴壁法简便易行、经济快捷、重复性好、成功率高，能获得高纯度、活性强的原代细胞，完全可以满足各类相关实验的需要，为从细胞水平对血管性疾病进行体外实验奠定了基础和提供了有价值的实验材料，值得推广。

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4 辛毅,龚达,习昕，等.酶联合消化法和贴块法分离小鼠肺动脉平滑肌细胞及其生物学特性的研究[J].中国生物工程杂志,2013,33(9):10-16.

5 彭公永,周玉民,胡国平，等.原代培养的大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的功能研究[J].中国药理学通报,2012,28(11):1570-1573.

6 Yang Q,Dahl MJ,Albertine KH,et al.Role of histone deacetylases in regulation of phenotype of ovine newborn pulmonary arterial smooth muscle cells[J].Cell Prolif，2013,46(6):654-664.

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