丹参制剂高效液相色谱指纹图谱研究现状

张 珺，程月发

(河北联合大学冀唐学院，河北唐山063300)

1 指纹图谱技术应用于丹参制剂质量标准研究的重要性

质量控制是中药现代化的重要内容，也是中药产业发展的瓶颈问题。现行的中药质量标准主要包括性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别及对某些药材的1～2个指标成分进行含量测定［1］。然而，中医理论强调整体效应，重视多个化学成分在药效上的协同作用，仅以少数成分作为定性、定量的指标远不能从整体上反映药材的质量，因此建立从整体上综合评价中药质量的方法是尤为重要的。近年来，将中药指纹图谱用于中药质量控制已成为人们的共识［2～4］。如美国食品药品监督管理局(FDA)和欧盟医药管理局(EMA)均在有关植物草药指南中将指纹图谱作为混合物的质量控制方法［5，6］;我国国家药典委员会发布的“2010年版《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求”，明确将中药指纹图谱作为中药鉴别和质量评价的一种方法，并对中药指纹图谱分析方法的建立、方法的验证、数据处理和计算分析等提出了具体要求(见国药典中发［2008］349号文件)。由此可见，采用指纹图谱质控技术，有望显著改善中药现代化的内涵，提高中药生产的现代化程度。

丹参作为传统中药，具有活血化瘀、凉血消痈和清心除烦的功效。其中有效成分主要包含两大类:具有水溶性的酚酸类成分和脂溶性的二萜醌类成分，其成方制剂在临床上应用广泛。目前，市场上的丹参剂型品种较多，主要分为两大类，一类是只以丹参药材入药，包括丹参片、丹参注射液、丹参胶囊和丹参颗粒等;另一类以丹参为君药，由丹参、三七等中药组成，包括复方丹参片、复方丹参滴丸、复方丹参颗粒、香丹注射液、丹参粉针剂、冠心丹参片和冠心丹参胶囊等。《中国药典》2010年版(一部)收录的丹参制剂有丹参片、复方丹参片、复方丹参滴丸和复方丹参颗粒，其中丹参片、复方丹参片和复方丹参颗粒是以丹参酮IIA和丹酚酸B的含量作为质量标准的，而复方丹参滴丸以丹参素的含量为质控指标［1］。然而现代药理学研究表明丹参制剂中很多化学成分药效都十分显著［7～9］，不能忽略其中各种不同性质成分的药效作用，因此很难从一种或几种指标成分的含量来评价丹参制剂的质量。另外，近几年由于丹参制剂的无序开发加大了其质量监管难度，在调查研究中发现同一种指标成分在不同厂家或同一厂家生产的不同批次的丹参制剂中含量差别较大。在本实验室的研究中也发现丹参胶囊中的一些成分如丹酚酸B、丹参素等在不同或同一厂家生产的不同批次的药品中含量存在一定差异［10，11］。显然，现行的丹参制剂相关质量控制标准是亟需改进的，建立一种新方法来全面有效评价丹参制剂的质量体系是十分必需的。现今公认中药指纹图谱技术是在现有条件下对中药材、中成药进行质量控制的最好解决方法，尤其在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，可以有效地表征中药质量和稳定性，还能够反映不同批次药物制品间质量的稳定性和一致性［12］。该项技术已逐渐被应用于建立丹参及其制剂质量标准的实验方法研究中［13～15］。

2 不同丹参剂型的指纹图谱在中药质量控制方面研究现状

目前，在中药质量控制方面主要以中药化学指纹图谱中的色谱指纹图谱特别是HPLC-DAD首选方法［4，14］，针对不同的丹参剂型进行研究。

2.1 丹参注射液指纹图谱 丹参注射液主要由丹参药材加工而成，为部颁标准收载品种。该剂型主要成分为水溶性的酚酸类化合物，质量标准仅以非主要活性成分原儿茶醛的含量作为质控指标，为完善其质量标准，一些研究采用指纹图谱的方法来评价产品质量。施超欧等［16］在早前利用LCMS法建立了丹参注射液的HPLC图，通过对比标准品及质谱分析确认了样品中5个水溶性成分，并指出其所测得丹参注射液中没有脂溶性成分，主要成分为水溶性的多羟基酚酸类化合物。虽然由于实验方法的局限性没有确认出更多的化学成分，但是这一研究为后来建立丹参注射液HPLC指纹图谱的色谱条件提供参考依据。陶金成等［17］测定了不同厂家不同批次的复方丹参注射液的指纹图谱，确立了19个共有峰，并指认了丹参素、原儿茶醛及丹酚酸B的色谱峰，该指纹图谱特征明显，指纹图谱分析结果表明不同厂家的注射液中特征成分含量差异较大，有的甚至不符合相关规定。由此看出，加强中药注射液的质量标准的控制和统一是非常必要的。李婧等［18］在丹参注射液指纹图谱研究中，确立了20个共有峰，并指认出5个特征的水溶性成分，为全面评价该制剂质量提供有效方法之一。Liu等［14］研究了丹参及其注射液中全成分的指纹图谱，并釆用标准品对照法和HPLC-MS联用技术确认了丹参中的34种成分，通过指纹图谱相似度评价分析结果表明该项技术能够对于丹参及其制剂的质量控制是合理有效的。张妍［19］对28批注射用丹参冻干粉指纹图谱进行了绘制，发现了28个共有峰，并指认出7个有效成分，为实现全面、快速、有效的评价丹参冻干粉提供质量控制模式。最近，Huang等［20］采用HPLC-UV和近红外光谱方法对来自3个不同厂家的共计50多个批次的丹参注射液进行图谱分析，相似度计算采用主成分分析(PCA)模型，组分鉴别用线性判别分析和近邻算法(k-NN)，另外通过计算Hotelling T2和DModX(Distance to model X block)统计量，建立质量监控图。结果发现，3厂家56批次产品的HPLC图谱存在14个共有峰，相同厂家的产品有一定的稳定性，但不同厂家之间的产品存在较大的差异，特别是在230～375 nm间，谱峰变异较大。

为了更全面有效控制丹参注射液的质量，应从原料药到药物中间体到产品进行质量监控，以免影响药品质量。在“中药注射剂指纹图谱研究技术要求”中也明确提出了方法学中应对中药材、有效部位、中间体和注射剂之间的相关性进行研究。近年来，一些关于丹参及含有丹参注射剂的研究也集中于此，张尊建等［21］采用HPLC-UV-MS法建立了丹参药材、丹参注射液中间体及丹参注射液的三种指纹图谱，认为三种图谱中具有一定相关性，但是在制备工艺过程中一些成分发生了化学变化致使这些成分在不同图谱中变化较大，虽然成分的鉴定及变化过程尚未明确，但是这项研究为指纹图谱从源头上全面控制丹参注射液的质量提供了一种新思路。Zhang等［22］的研究也表明丹参注射液及其原药材的指纹图谱中一些成分及含量存在差异，该项研究中还测定了不同批次的丹参注射液，并确认了11个水溶性成分的特征峰，且发现丹酚酸类活性物质在大鼠血浆中的代谢存在很大差异。张晓茹等［23］建立了注射用丹参粉针剂-中间体-药材HPLC指纹图谱，研究表明三者相关性良好，并指出丹酚酸B在制备过程中分解为原儿茶醛和丹参素，因此在注射剂中没有检测到丹酚酸B。

此外，还有一些研究不仅局限在丹参注射液的化学成分的指纹上，还研究了药效指纹图谱。Chang等［24］对不同厂家丹参注射液药效指纹图谱进行了聚类分析，研究了化学成分与药效(谱-效)相关性，并指出该方法对丹参注射液质量控制更为有效。

2.2 丹参片指纹图谱 丹参片是临床常用的一种中成药，它是由单味丹参提取浸膏后制成的，为中国药典收载品种，在治疗冠心病、脑梗死等疾病上疗效理想。但目前丹参片的指纹图谱研究还相对较少，张青云等［25］仅建立了丹参片中脂溶性成分HPLC指纹图谱的测定方法，但是对于非脂溶性成分指纹图谱并没有研究，而雷敏等［26］只建立了丹参片水溶性成分的HPLC指纹图谱。这些并不足以全面评价丹参片的质量，但是也为完善指纹图谱作为丹参片的质量控制手段提供了一些依据。张聪等［27］通过建立丹参药材、中间体及丹参片的HPLC指纹图谱，揭示了中药制剂与原药材和中间体的基源相关性，并探讨了不同类型的成分在制备过程中的变化情况及原因。

2.3 复方丹参片指纹图谱 复方丹参片是1975年由上海中药二厂研制出的复方制剂，由丹参浸膏、三七和冰片组成，《中国药典》1977年版至2010年版均有收录，是临床治疗冠心病、胸闷和心绞痛的常用中成药。由于其疗效确切，不良反应少，价格低廉，市场需求量大，因此生产厂家也较多，但是不同厂家的技术设备条件及原料药的差异，势必引起产品质量的差异。为了全面有效的控制复方丹参片的质量，曾令杰等［28］首次采用了有效成分的定量分析和指纹图谱相结合的方法对不同厂家的复方丹参片进行评价。该法能够将复方丹参片中的水溶性成分和脂溶性成分在同一图谱上表现出来，图谱中共有10个特征性的指纹峰，并确认了丹参酮ⅡA、丹酚酸B和丹参素3种活性成分，可以说为全面评价复方丹参片等复方丹参制剂的质量奠定基础。孙守国［29］建立的复方丹参片指纹图谱中共存在20个共有峰，而黄琳等［30］构建的复方丹参片HPLC指纹图谱中有25个共有特征峰，并确认了8个主要成分的色谱峰。王颖［31］在复方丹参片的指纹图谱中标定出了8个指纹特征峰并分析其归属，为复方丹参片有效成分的追踪分离及中成药的二次开发奠定了基础。勾晓洲等［32］则通过复方丹参片HPLC指纹图谱考察了共有成分的不同时间内的稳定性。雷敏等［26］虽建立了复方丹参片水溶性成分HPLC指纹图谱，但在这项研究中却探讨了一些水溶性成分从原料药到成品制剂中含量的变化，指出临床上主要以丹参水溶性成分入药的丹参制剂，需要严格控制在制备工艺过程中主要有效成分的变化，以保证临床用药的有效性。

一些研究不仅仅只停留在复方丹参片指纹图谱方法的确立上，还进一步深入研究了复方丹参片标准指纹图谱的建立方法。孙国祥等［33，34］以双定性相似度均值和双定量相似度均值为参量，通过对20批复方丹参片进行系统聚类分析，确定用其中10批生成复方丹参片标准指纹图谱，以此图谱为标准对总计20批复方丹参片采用双定性双定量相似度法进行质量评价。该法确定40个指纹共有峰，不仅能反映了批次间的差异，对产品的稳定性和真实性的评价也较为理想;而后又采用多级系统指纹定量法应用于复方丹参片HPLC指纹图谱评价［35］。严玉平等［36］以中位数法模拟了复方丹参片的对照指纹图谱并同法同时测定丹参酮ⅡA的含量。

2.4 复方丹参滴丸指纹图谱 1997年12月9日，复方丹参滴丸以药品的身份正式通过美国食品与药物管理局的临床用药申请，成为我国第一个通过美国FDA的临床用新药申请的中药制剂，实现了中药正式进入国际医药主流市场的历史性突破，并被国家列为临床急救必备的药物之一，影响广泛［37］。该药也是目前药典标准中收录有标准指纹图谱的唯一丹参类制剂。2004年天津天士力制药股份有限公司在承担国家科技攻关计划—指纹图谱应用示范研究时，创建了多元化学指纹图谱技术，该技术对复方丹参滴丸的主要化学成分进行了系统分析，鉴定出10种丹参水溶性成分和20种三七皂苷类成分，较完整地表征了复方丹参滴丸的整体化学组成特征。它不仅首次创造性地提出多元化学指纹图谱技术概念及其技术方法学，建立了复方丹参滴丸指纹图谱分析方法，同时还首次研制创建了多元指纹图谱相似度计算分析软件系统，保证了研究结果的可验证性和科学严谨性［38］。此后一些研究也集中建立用多元化学指纹图谱来控制复方丹参滴丸的质量。范骁辉等［39］也采用多元复方丹参滴丸HPLC指纹图谱考察了产品批次间质量的稳定性，该法分别建立了产品中丹参酚酸类成分和三七皂苷类成分的HPLC指纹图谱，为提高复方丹参滴丸的质量标准提供了依据。Fan等［40］采用二元色谱指纹图谱技术绘制了复方丹参滴丸中丹参和三七两种成分的指纹图谱。

同样如复方丹参片，一些研究也关注复方丹参滴丸指纹图谱的评价方法。孙国祥等［41～43］采用双定性双定量相似度作为评价指标，分别建立了复方丹参滴丸及其在低波长紫外吸收指纹成分的控制方法，实现了对复方丹参滴丸全面数字化的信息质量控制。此外关于复方丹参滴丸的毛细管电泳指纹图谱也有研究［44，45］，为复方丹参滴丸质量控制提供了新的参考。

3 结语与展望

综上所述，中药指纹图谱是一种综合、可量化的手段，它与现行的单一指标成分或活性成分为测定标准的方法相比，其所含的信息更为科学合理。目前，指纹图谱研究仍然局限于少数的丹参制剂，主要有丹参注射液、丹参片、复方丹参片和复方丹参滴丸等，而HPLC指纹图谱上升为《中国药典》2010年版(一部)标准的只有复方丹参滴丸，仍有几十种丹参制剂的质量标准缺乏指纹图谱要求。由此可见，关于丹参制剂指纹图谱的标准图谱的研究应进一步深入和完善，特别是药典收录的品种，应该尽早将有关标准指纹图谱列入药品质量管理文件，以规范丹参药品的活性组分，达到保证药品质量的目的。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:70，580，904-906.

［2］谢培山.刍议中药指纹图谱的现状、发展和问题［J］.中药材，2007，30(3):257-259.

［3］崔红华，邱夏.中药质量标准现代化研究发展趋势［J］.中国中医药信息杂志，2007，14(6):6-7.

［4］Liang Y，Xie P，Chau F.Chromatographic fingerprinting and related chemometric techniques for quality control of traditional Chinese medicines［J］.J Sep Sci，2010，33(3):410-421.

［5］US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration.FDA Guidance for Industry-Botanical Drug Products［S］.5600 Fishers Lane，Rockville，MD，USA，2004.

［6］European Medicines Agency.Note for Guidance on Quality of Herbal Medicinal Products［S］.London，UK，EMEA，2001.

［7］潘蓉，李玲.丹参水提物对心肌缺血/再灌注损伤大鼠心率及心肌酶谱的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(4):232-234.

［8］Yu XQ，Xue CC，Zhou ZW，et al.Tanshinone IIB，a primary active constituent from Salvia miltiorrhiza，exerts neuroprotective effect via inhibition of neuronal apoptosis in vitro［J］.Phytother Res，2008，22(6):846-850.

［9］Qiu F，Zhang R，Sun J，et al.Inhibitory effects of seven components of danshen extract on catalytic activity of cytochrome P450 enzyme in human liver microsomes［J］.Drug Metab Dispos，2008，36(7):1308-1314.

［10］程月发，蓝建芳，张珺，等.丹参胶囊中丹参酮ⅡA及丹酚酸B含量测定方法研究［J］.齐鲁药事，2012，31(7):397-399.

［11］张珺，程月发，张爱兵，等.不同厂家的丹参片和丹参胶囊中四种活性成分的高效液相色谱法比较分析［J］.时珍国医国药，2012，23(11):59-60.

［12］马梅芳，李洁.对中药质量控制的思考［J］.中医药导报，2007，13(l2):15-17.

［13］王立萍，周凤琴.近十年来丹参指纹图谱的研究进展［J］.齐鲁药事，2009，28(2):101-103.

［14］Liu AH，Lin YH，Yang M，et al.Development of the fingerprints for the quality of the roots of Salvia miltiorrhiza and its related preparations by HPLC-DAD and LC-MS(n)［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，846(1-2):32-41.

［15］Xie P，Chen S，Liang Y，et al.Chromatographic fingerprint analysis—a rational approach for quality assessment of traditional Chinese herbal medicine［J］.J Chromatogr A，2006，1112(1-2):171-180.

［16］施超欧，陶萍.丹参注射液主要成分的HPLC及LCMS定性分析［J］.世界科学技术(中药现代化)，2001，3(5):29-33.

［17］陶金成，钱文，宋少刚，等.不同厂家复方丹参注射液质量考察［J］.中国药房，2005，16(12):937-939.

［18］李婧，刘汉清，孙小芬.丹参注射液多成分定量测定和指纹图谱研究［J］.中成药，2011，33(4):553-556.

［19］张妍.丹参及注射用丹参(冻干粉)质量评价研究［D］.兰州大学，2012:35-45.

［20］Huang H，Qu H.A comparative fingerprint study using high-performance liquid chromatography，ultraviolet，and near-infrared spectroscopy to evaluate the quality consistency of Danshen injections produced by different manufacturers［J］.Analytical Methods，2013，5(2):474-482.

［21］张尊建，李茜，王伟，等.丹参及丹参注射液指纹图谱的 HPLC-MS研究［J］.中草药，2002，33(12):1074-1076.

［22］Zhang J，Cui M，He Y，et al.Chemical fingerprint and metabolic fingerprint analysis of Danshen injection by HPLC – UV and HPLC – MS methods［J］.J Pharm Biomed Anal，2005，36(5):1029-1035.

［23］张晓茹，王宝华，宋歌，等.注射用丹参粉针剂-中间体-药材HPLC指纹图谱及其相关性研究［J］.北京中医药大学学报，2011，34(11):769-774.

［24］Chang YX，Yan DM，Chen LL，et al.Potency fingerprint of herbal products Danshen injection for their quality evaluation［J］.Chem Pharm Bull(Tokyo)，2009，57(6):586-590.

［25］张青云，崔田.丹参片脂溶性成分HPLC指纹图谱研究［J］.淮海医药，2011，29(1):66-67.

［26］雷敏，宋敏，王爽，等.丹参制剂中丹参水溶性成分的指纹对照法质量分析［J］.中国药科大学学报，2008，39(3):238-242.

［27］张聪，韩晓锦.丹参药材-中间体-丹参片的HPLC指纹图谱及其相关性研究［J］.中成药，2010，32(10):1656-1662.

［28］曾令杰，陈矛，邓乔华，等.复方丹参片指纹图谱的质量评价研究［J］.广东药学院学报，2002，18(3):182-184.

［29］孙守国.复方丹参片的HPLC指纹图谱研究［J］.中成药，2009，31(3):339-342.

［30］黄琳，姚小华，林青，等.复方丹参片指纹图谱研究［J］.现代中药研究与实践，2012，26(4):66-69.

［31］王颖.复方丹参片 HPLC指纹图谱研究［J］.中国药房，2010，21(23):2162-2163.

［32］勾晓洲，付春梅，刘三康，等.指纹图谱评价复方丹参片的稳定性［J］.华西药学杂志，2009，24(4):377-378.

［33］孙国祥，池剑玲，赵新，等.HPLC指纹图谱对复方丹参片的信息质量控制研究［J］.中南药学，2008，6(5):611-616.

［34］孙国祥，池剑玲，宋宇晴.HPLC指纹图谱控制复方丹参片质量［J］.沈阳药科大学学报，2008，25(12):971-978.

［35］孙国祥，李闫飞，池剑玲，等.多级系统指纹定量法评价复方丹参片质量［J］.中南药学，2012，10(2):140-144.

［36］严玉平，同利琪，郭聪，等.复方丹参片指纹图谱及含量测定研究［J］.中成药，2009，31(8):1149-1151.

［37］向柏，潘振华，曹德英.复方丹参滴丸质量控制和药理学研究进展［J］.中国药房，2007，18(9):708-710.

［38］何毅，孙鹤.复方丹参滴丸质量控制研究综述［A］.2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集［C］.2010.

［39］范骁辉，叶正良，程翼宇.复方丹参滴丸批次间质量稳定性评价方法研究［J］.药物分析杂志，2005，25(9):1122-1124.

［40］Fan XH，Cheng YY，Ye ZL，et al.Multiple chromatographic fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicines［J］.Analytica Chimica Acta，2006，555(2):217-224.

［41］孙国祥，宋宇晴.用RP-HPLC指纹图谱控制复方丹参滴丸中低波长紫外吸收指纹成分［J］.中南药学，2009，7(4):304-307.

［42］孙国祥，宋宇睛.复方丹参滴丸 HPLC数字化指纹图谱研究［J］.中成药，2009，31(8):1152-1155.

［43］孙国祥，宋宇晴.基于HPLC指纹图谱的系统指纹定量法评估复方丹参滴丸质量［J］.中南药学，2009，7(4):297-300.

［44］李霞，王宏钊，李继，等.复方丹参滴丸HPCE指纹图谱的建立［J］.中成药，2009，31(5):660-663.

［45］孙国祥，毕开顺.中药指纹图谱学体系在中药创制中的作用［J］.色谱，2008，26(2):172-179.