Btk抑制剂的研究进展

邓 容，赵利枝

(鲁南制药集团股份有限公司，山东临沂276005)

Btk(Bruton's tyrosine kinase)即布鲁顿酪氨酸蛋白激酶，是非受体酪氨酸激酶Tec家族的成员。1952年美国医生Ogden Bruton发现性联无丙种球蛋白血症，并命名为Bruton综合症。1993年de Weers等［1］发现并命名为Btk，在前B淋巴细胞过渡为后期B细胞过程中，Btk为细胞分化和增值所必需基因，且在B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)和浆细胞瘤中均有表达。但是仍没有关于靶向小分子抑制剂和相关药理研究。直到2006年之后，研究者发现磷酸化激活Btk为B细胞受体(BCR)信号通路的关键组成部分，是靶向治疗B细胞淋巴瘤等疾病的很好位点［2］。

Btk参与多种信号通路，与PI3K(磷脂酰肌醇－3－激酶)、G2蛋白双受体等结合后发生激活，通过PLCg2(磷脂酶Cg2)、PKC－βⅠ(蛋白激酶C－βⅠ)等下游信号分子，参与对血管生成、细胞增殖和凋亡以及细胞运动的调节［3］。除此之外，Btk还参与到许多其他造血细胞信号途径，例如，参与巨噬细胞中Toll样受体和细胞因子受体介导的信号通路，参与肥大细胞中IgE受体的信号传导等［4］。

近年来研究显示，Btk信号通路是目前非霍奇金淋巴瘤(NHL)，特别是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤及自身免疫疾病临床治疗研究中的新热点。本文将就Btk激酶抑制剂的分子作用机理及其临床研究予以概述。

1 Btk激酶抑制剂的作用机理

除了T淋巴细胞和自然杀伤细胞之外，Btk是其他所有造血细胞类型中表达的关键信号酶。B细胞表面的BCR与其抗原结合，通过抗原诱导BCR聚集，激活下游的Lyn和Fyn等Src家族分子，激活的Src家族磷酸化在Tyr551和Tyr223位点的Btk。活化的Btk可通过进一步磷酸化PLCg2升高细胞内钙离子浓度，MAPKs、NF－κB和AKT信号通路的激活等，可能刺激磷酸酶中这些位点的磷酸化作用，从而调控基因和细胞因子的表达，影响B细胞的存活、增殖和分化［5］。

Btk由PH结构域、TH结构域、SH3结构域、SH2结构域和SH1/TK结构域等5部分组成［6］，所有酪氨酸激酶中仅Btk含有PH结构域。Btk首次激活在SH1/TK结构区，进一步激活在SH3和SH2结构区，包括主要的自身磷酸化位点。PH结构区包括转录因子BAP－135/TFII－I的连接位点，抑制剂如PIN1、IBtk(Btk抑制剂)的抑制部分，调节Btk和PIP的相互作用。Btk和PIP3结合后转移到细胞膜成为膜型，自我磷酸化，由Lyn和Syk激酶反式磷酸化而激活。临近PH结构区的部分是TH结构区，为PKC－β连接位点。PKC－β能在Ser－180直接磷酸化TH结构区，使Btk回到胞质层。和PIN1、SH3BP5、CAV1及IBtk的相互作用也能下调Btk的激酶活性。通过PH区域、活化循环中的Y551、SH3区域的Y223自身磷酸化位点控制Btk，阻断SH3区域可激活Btk。ATP连接位点和抑制片段在SH1/TK结构区［7］。

在X连锁无丙种球蛋白血症中，Btk突变会破坏Btk功能，致使患者体内缺乏抗体和成熟的外周B淋巴细胞。Btk在骨髓细胞功能中通过免疫复合体激活FcγR信号。在巨噬细胞中，Btk抑制能阻断 FcγRIII诱导的 TNF－α、IL－1β和IL－6产物，通过NF－κB活化阻断BCR依赖的B细胞增殖，这为Btk在自身免疫疾病和B细胞淋巴瘤的治疗提供了有力证据［8］。成熟B细胞的淋巴增殖紊乱，如基底生长、存活、肿瘤进展等，可异常调节Btk活性。Btk的激活是CLL的必要条件，能使CLL小鼠模型中白血病增多。另外，改变BCR－Btk信号通路能改善DLBCL中活化B细胞样亚型的细胞存活。结直肠癌、ALL、CML也和Btk的变化有关［7］。

2 已上市及临床研究中的小分子Btk抑制剂

2.1 Ibrutinib Ibrutinib(依鲁替尼，PCI 32765，商品名:Imbruvica)，由美国Pharmacyclics inc研发，于 2013年11月被FDA批准用于治疗既往接受至少1次治疗的套细胞淋巴瘤(MCL)，2014年2月又批准用于既往至少接受过一种药物治疗的CLL。Ibrutinib胶囊的规格为140 mg/粒，口服每天1次，每次560 mg。

在111例复发或难治的MCL患者中进行的Ⅱ期临床试验［9］，患者中位年龄68岁(40～84岁)，86%患者为中危或高危。自诊断来中位时间为42个月，中位既往治疗次数为3(1～5次治疗)。患者被分为两组，每天1次，每次服用Ibrutinib胶囊560 mg，直至疾病进展或出现不能接受的毒性反应。主要终点即总应答率为68%，完全应答为21%，部分应答为47%。18个月的总生存率为58%。最常见的治疗相关的不良反应为轻度到中度的腹泻、疲劳和恶心。3级或以上血液学反应少见，包括中性粒细胞减少、血小板减少和贫血。Ⅰb－2临床试验［10］招募的 85例复发或难治的CLL/SLL患者中，大部分患者为高危患者，口服Ibrutinib每天1次，51例420 mg，34例840 mg。两组的总应答率均为71%，420 mg组的部分应答率为20%，840 mg为15%。在26个月，可评估的无进展生存率为75%，总生存率为83%。

Burger JA等［11］在40例高危 CLL/SLL患者中，治疗方案包括Ibrutinib 420 mg每天1次和利妥昔单抗每周1次，共4周;继而以Ibrutinib每天1次+利妥昔单抗每月1次治疗，共6个月;随后行Ibrutinib单药治疗。40例患者中有38例持续接受治疗，疾病无进展。20例患者在治疗3个月时接受了早期疗效评估，其中有17例达到了部分缓解，总体缓解率为85%。另有3例患者也达到了部分缓解，但伴有持久性淋巴细胞增多症。与Ibrutinib单药治疗相比，加入利妥昔单抗后，患者的治疗效果出现更快。Ibrutinib和ACY1215合用于MCL，能使细胞凋亡增加3倍［12］。Ⅰb/Ⅱ期临床研究证实将Ibrutinib和奥法木单抗合用于既往治疗的复发或难治CLL/SLL［13］。Ibrutinib+苯达莫司汀+利妥昔单抗用于复发或难治CLL/SLL的Ⅲ期试验正在进行，预计2015年完成。

Ibrutinib治疗华氏巨球蛋白血症(WM)的一项Ⅱ期临床已经完成，正进行Ⅲ期临床试验。

2.2 CC－292 CC－292(又名AVL－292)是美国Celgene公司研发的口服、高选择性Btk抑制剂，用于治疗B细胞相关的血液系统恶性肿瘤，包括NHL、CLL及自身免疫和炎性疾病，包括RA和全身性红斑狼疮(SLE)。化学名为N－(3－(5－氟－2－(4－(2－甲氧乙氧基)苯氨基)嘧啶－4－氨基)苯基)丙烯酰胺。研究证实CC－292结合的Btk的数量和CC－292在自身免疫疾病的胶原诱发性关节炎模型中的效能有关。健康志愿者的临床试验证实口服单剂量的CC－292 mg·kg－1能连续地和所有循环的Btk作用，PK分析表明CC－292能被快速吸收，30～120 min内达到血浆峰值浓度，中位消除半衰期为 1.9 h［14］。

BTK对破骨细胞(OC)功能也有影响。研究者证实虽然CC－292能增加OC分化，但也能通过抑制c－Src、Pyk2等所有与OC封闭带形成有关的蛋白而抑制OC功能。Carfilzomib不能影响OC封闭带的形成，但能明显抑制OC分化。CC－292和Carfilzomib合用能抑制封闭带的形成和OC分化，能更多的抑制OC功能。这些结果为治疗MM和相关骨疾病提供治疗依据［15］。

CC－292用于B细胞疾病的Ⅰb临床研究结果显示，在86例复发或难治性CLL和B－NHL患者中，耐受性好的剂量范围为日剂量125～1 000 mg，即每天2次，每次375和500 mg［16］。最常见的治疗相关的不良事件包括腹泻、疲劳、头痛和肌肉痉挛。在50例CLL患者中，17例(34%)部分应答。

2.3 ONO－4059 ONO－4059是日本Ono公司研发的用于治疗B细胞淋巴瘤的Btk抑制剂，能与Btk共价结合，可逆性阻止BCR信号通路和B细胞增殖、激活。ONO－4059的IC50为2.2 nmol·L－1。在小鼠 CIA 模型中，ONO －4059通过抑制炎症趋化因子和细胞因子，包括IL－6、IL－8和单核细胞的TNFα，同时软骨破坏、骨损伤和血管翳形成减少，发挥治疗作用。在细胞基础分析中，ONO－4059分别在IC505.66 nmol·L－1和 22.4 nmol·L－1抑制单核细胞内 FcR 诱导的TNF和 IL－6形成。在10 nmol·L－1范围内，ONO－4059阻止B细胞激活，而不影响T细胞激活［17］。

ONO－4059能抑制TMD－8细胞生长和Btk磷酸化，4 h IC50为 23.9 nmol·L－1，72 h IC50为 3.59 nmol·L－1。减少BTK磷酸化能下调 ERK磷酸化。10 nmol·L－1的 ONO－4059 分别和 25 nmol·L－1的多柔比星、500 nmol·L－1依托泊苷、1.5 nmol·L－1的长春新碱、1 000 nmol·L－1的地塞米松合用，细胞凋亡比率增加25、20、17和 29%［18］。数据显示ONO－4059用于RA治疗。ONO－4059用于复发或难治性CLL的Ⅰ期临床正在进行。

2.4 HM71224 HM71224是韩国Hanmi公司研发的口服、小分子的Btk抑制剂，用于治疗RA。2013年1月开始在62例健康成年男性志愿者中进行随机、安慰剂对照的Ⅰ期临床试验，评价多个剂量的安全性、耐受性、药动学、药效学等［19］。

2.5 其他 除了前述药物，还有一些进入临床前研究的药物，如罗氏公司的 RN －486［20］，美国 Gilead Sciences的 CGI－ 1746［21］，Genentech 和 CGI Pharmaceuticals 的 GDC －0834［22］等，体外研究均显示出抗RA的作用。

3 结语

小分子Btk抑制剂通过作用于BCR信号通路，与Btk结合而抑制Btk自身磷酸化，阻止Btk的激活，从而阻断细胞传导并诱导细胞凋亡。Btk抑制剂选择性强，毒副作用低，特别是Ibrutinib的上市，被FDA定为“突破性”新药，其研究开发前景广阔。随着Btk抑制剂作用机制研究和临床试验的深入，会有更多的小分子Btk抑制剂逐步上市，对血液系统肿瘤和关节炎等疾病治疗起到重要作用。

［1］de Weers M，Verschuren MC，Kraakman ME，et al.The Bruton＇s tyrosine kinase gene isexpressed throughout B cell differentiation，from early precursor B cell stages preceding immunoglobulin gene rearrangement up to mature B cell stages［J］.Eur J Immunol，1993，23(12):3109－3114.

［2］Hendriks RW，Kersseboom R.Involvement of SLP － 65 and Btk in tumor suppression and malignant transformation of pre － B cells［J］.Semin Immunol，2006，18(1):67－76.

［3］Mueller H，Stadtmann A，Van Aken H，et al.Tyrosine kinase Btk regulates E－selectin－mediated integrin activation and neutrophil recruitment by controlling phospholipase C(PLC)gamma2 and PI3Kgamma pathways［J］.Blood，2010，115(15):3118 －3127.

［4］Liljeroos M，Vuolteenaho R，Morath S，et al.Bruton＇s tyrosine kinase together with PI 3－kinase are part of Tolllike receptor 2 multiprotein complex and mediate LTA induced Toll－like receptor 2 responses in macrophages［J］.Cell Signal，2007，19(3):625 －633.

［5］Suzuki－ Inoue K，Wilde JI，Andrews RK，et al.Glycoproteins VI and Ib－IX－V stimulate tyrosine phosphorylation of tyrosine kinase Syk and phospholipase Cgamma2 at distinct sites［J］.Biochem J，2004，378(Pt 3):1023－1029.

［6］Okoh MP，Vihinen M.Interaction between Btk TH and SH3 domain［J］.Biopolymers，2002，63(5):325 －334.

［7］Akinleye A，Chen Y，Mukhi N，et al.Ibrutinib and novel BTK inhibitors in clinical development［J］.J Hematol Oncol，2013，6:59.

［8］Tai YT，Chang BY，Kong SY，et al.Bruton tyrosine kinase inhibition is a novel therapeutic strategy targeting tumor in the bone marrow microenvironment in multiple myeloma［J］.Blood，2012，120(9):1877 －1887.

［9］Wang ML，Rule S，Martin P，et al.Targeting BTK with ibrutinib in relapsed or refractory mantle－cell lymphoma［J］.N Engl J Med，2013，369(6):507 － 516.

［10］Byrd JC，Furman RR，Coutre SE，et al.Targeting BTK with ibrutinib in relapsed chronic lymphocytic leukemia［J］.N Engl J Med，2013，369(1):32 －42.

［11］Burger JA，Keating MJ，Wierda WG，et al.The Btk Inhibitor Ibrutinib(PCI－32765)in Combination with Rituximab Is Well Tolerated and Displays Profound Activity in High－Risk Chronic Lymphocytic Leukemia(CLL)Patients［C］.Atlanta:54th ASH Annual Meeting and Exposition，2012:187.

［12］Sahakian E，Rock － Klotz J，Shah BD，et al.Combination of ACY1215，a Selective Histone Deacetylase 6(HDAC6)Inhibitor with the Bruton Tyrosine Kinase(BTK)Inhibitor，Ibrutinib，Represents a Novel Therapeutic Strategy in Mantle Cell Lymphoma(MCL)［C］.Atlanta:54th ASH Annual Meeting and Exposition，2012:1660.

［13］Jaglowski SM，Jones JA，Flynn JM，et al.A phase Ib/II study evaluating activity and tolerability of BTK inhibitor PCI－32765 and ofatumumab in patients with chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma(CLL/SLL)and related diseases［J］.J Clin Oncol，2012，30(Suppl):abstr 6508.

［14］Evans EK，Tester R，Aslanian S，et al.Inhibition of Btk with CC－292 provides early pharmacodynamic assessment of activity in mice and humans［J］.J Pharmacol Exp Ther，2013，346(2):219 －228.

［15］Eda H，Santo L，Cirstea DD，et al.A novel Bruton's tyrosine kinase inhibitor CC－292 in combination with the proteasome inhibitor carfilzomib impacts the bone microenvironment in a multiple myeloma model with resultant antimyeloma activity［J］.Leukemia，2014，10:1038

［16］Brown J.Phase 1 study of single agent CC －292，a highly selective Bruton's tyrosine kinase(BTK)inhibitor，in relapsed/refractory chronic lymphocytic leukemia(CLL)and B－cell non－Hodgkin lymphoma(B－NHL)［C］.Stockholm:The 18th Congress of the European Hematology Association(EHA)，2013.

［17］Yoshizawa，Toshio，Ariza，et al.Development of a Bruton's Tyrosine Kinase(Btk)Inhibitor，ONO －4059:Efficacy in a Collagen Induced Arthritis(CIA)Model Indicates Potential Treatment for Rheumatoid Arthritis(RA)［J］.Arthritis Rheum，2012，64(Suppl 10):1660.

［18］Yasuhiro T，Yoshizawa T，Birkett JT，et al.ONO －4059，A Novel Bruton's Tyrosine Kinase(Btk)Inhibitor:Synergistic Activity In Combination With Chemotherapy In a ABC－ DLBCL Cell Line［J］.Blood，2013，122(21):5151.

［19］Bodiam S.The Ones To Watch:A Pharma Matters Report［R］.Thomson Reuters，2013.

［20］Xu D，Kim Y，Postelnek J，et al.RN486，a selective Bruton's tyrosine kinase inhibitor，abrogates immune hypersensitivity responses and arthritis in rodents［J］.J Pharmacol Exp Ther，2012，341(1):90 －103.

［21］Di Paolo JA，Huang T，Balazs M，et al.Specific Btk inhibition suppresses B cell－ and myeloid cell－mediated arthritis［J］.Nat Chem Biol，2011，7(1):41 －50.

［22］Liu L，Di Paolo J，Barbosa J，et al.Antiarthritis effect of a novel Bruton's tyrosine kinase(BTK)inhibitor in rat collagen－induced arthritis and mechanism－based pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling:relationships between inhibition of BTK phosphorylation and efficacy［J］.J Pharmacol Exp Ther，2011，338(1):154 －163.