双向电泳分析精索静脉曲张不育患者精子蛋白质的表达差异

何 犇李 强*卓 晖唐 伟杨敏美

1.重庆医科大学附属成都第二临床学院/成都市第三人民医院泌尿外科（成都 610031）；2. 重庆医科大学附属第一医院泌尿外科; 3.四川省中西医结合医院心内科

双向电泳分析精索静脉曲张不育患者精子蛋白质的表达差异

何 犇1李 强1*卓 晖1唐 伟2杨敏美3

1.重庆医科大学附属成都第二临床学院/成都市第三人民医院泌尿外科（成都 610031）；2. 重庆医科大学附属第一医院泌尿外科; 3.四川省中西医结合医院心内科

目的比较分析正常生育男性与精索静脉曲张（varicocele, VC）不育患者差异表达的精子蛋白质。方法应用计算机辅助精子分析系统行精液分析，采取Percoll密度梯度离心法提取正常生育男性与VC不育患者精子，利用双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）分离精子蛋白质，建立并优化精子蛋白质2-DE图谱，利用PDQuest8.0软件分析两组蛋白质的差异表达。结果正常生育组精子活力高于VC不育组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），两组精子密度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。获得了分辨率和重复性均较好的2-DE图谱，两组差异点共36个，VC不育组有11个蛋白位点表达上调，19个蛋白位点表达下调，2个在VC不育组特异性表达，4个在正常生育组特异性表达。结论 VC不育患者与正常生育男性的精子蛋白存在差异，这些差异蛋白质的分离为深入探讨VC导致不育的分子机制奠定了基础。

精子; 蛋白质类; 精索静脉曲张; 电泳, 凝胶, 双向; 蛋白质组学

精索静脉曲张（varicocele, VC）系指精索蔓状静脉丛因各种原因引起回流不畅或因静脉瓣损坏引起血液倒流而形成局部静脉扩张、迁曲、伸长的病理现象[1]。VC是男性不育的常见原因，在男性人群中发病率为15%～20%[2]，世界卫生组织已把VC列为男性不育的首位病因[3]。目前为止，VC引起男性不育的机制尚不完全清楚。

蛋白质组学(proteomics)是研究一个细胞、一类组织或一种生物的基因组所表达的全部蛋白质[4]。双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）是蛋白质组研究的核心技术之一[5]，是当前用于寻找差异表达蛋白质的有效手段。本研究采用2-DE分离正常生育男性与VC不育患者精子蛋白质，通过建立的2-DE图谱，比较分析差异表达的精子蛋白质，为进一步探讨VC导致男性不育的分子机制奠定基础。

材料和方法

一、材料

蛋白质定量试剂盒和PMSF均由碧云天生物技术研究所提供；Percoll为Bioshorp公司产品；固相化pH梯度胶条（immobilized pH gradient IPG 17cm pH5-8）、Bio-Lyte、clean-up kit试剂盒及尿素均购自美国Bio-Rad公司；硫脲、CHAPS、二硫苏糖醇（DTT）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、碘乙酰胺（IAA）、十二烷基磺酸钠（SDS）、过硫酸铵（APS）、五水硫酸钠、碳酸钠均购自加拿大BBI公司；40%丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺购自上海生物工程有限公司；其他试剂为国产分析纯，所有试剂均用MQ水配制。

（二）精液样品采集

共收集35份（例）精液标本，其中正常生育男性精液（对照组）10份（例），VC不育患者精液（实验组）25份（例）。研究对象：（1）成年男性，年龄20～35岁，从事非有害有毒工作；（2）无吸烟史或吸烟极少，不善于饮酒和近2周未饮酒；（3）实验组符合双侧Valsalva法Ⅱ-Ⅲ级VC的诊断标准，男性患者的女方妇科检查正常，但婚后同居一年之上无怀孕史。所有样本均禁欲7d后，采取手淫法收集，并经过伦理道德委员会批准和获得志愿者签署知情同意书。

二、方法

（一）精液分析与精子蛋白提取

37℃水浴箱内精液液化15～30min后，采用计算机辅助精子分析系统（computer-assisted semen analysis, CASA）分析精液结果。根据处在不同成熟阶段的精子和各种细胞成分有一定的密度差异，在4℃采用50% Percoll密度梯度离心法800g×20min以去除精浆和圆细胞[6]。用Hepes液连续悬浮沉积物并离心2×10min，用洗涤缓冲液调整精子浓度到1×106个/mL。将精子细胞加入终浓度为1mmol/L的PMSF、EDTA和各10U/mL的DNaseⅠ，RNaseA酶中，摇匀后反复冻融破碎细胞。随后加入裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，65mmol/lDTT，0.2%（w/ v）的Ampholyte，0.001%（w/v）的溴酚蓝）冰浴条件下裂解精子样品。将获得透明澄清的精子总蛋白溶液在4℃，20 000×g，离心10min，收集上清采用改良Bradford法进行蛋白定量。采取clean-up kit法按照试剂盒说明书操作去除杂质后，用裂解液重溶。获得的蛋白样品存放在-80℃备用。

（二）等电聚焦（IEF）电泳

从-80℃冰箱中取样本后室温溶解，加入上样水化液（7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%(m/v) CHAPS、65mmol/LDTT、0.2%Bio-Lyte、0.001%（w/v）的溴酚蓝），采用250μg的上样量，pH5-8的胶条，主动水化方式行等电聚焦。

（三）十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

罗四强突然伸出手机，说：“阿里，你听这个。”他说着，按了一个键。哀乐立即响了起来。虽然夹着杂音，却也低沉婉转地回荡在房间里。

将等电聚焦后的IPG胶条于5mL平衡缓冲液Ⅰ（6mol/L尿素、2%SDS 0.375mol/L Tris-HCl pH 8.8、20%甘油、2%DTT）内摇床振荡平衡15min；换用平衡缓冲液Ⅱ（6mol/L尿素、2%SDS、0.375mol/L Tris-HCl pH 8.8、20%甘油、2.5%IAA）振荡平衡15min。将平衡好的胶条移至12%的聚丙烯酰胺凝胶上端，上部用0.5%低溶点琼脂糖封胶。设置电泳参数进行二向垂直平板SDS-PAGE。

（四）凝胶染色及图像分析

采用改良硝酸银法。银染固定液（体积分数50%甲醇，体积分数10%乙酸）固定凝胶2h；体积分数50%乙醇洗涤液漂洗3次，10min/次；敏化液（0.2%硫代硫酸钠）敏化2min；超纯水洗涤3次，5min/次；加新配制的银染液（0.2%AgNO3、体积分数0.075%甲醛）避光银染25min后超纯水漂洗3次，1min/次；加显色液（2%无水碳酸钠、0.0004%硫代硫酸钠、体积分数0.05%甲醛）反应4～15min后，终止液（体积分数50%甲醇，体积分数10%乙酸）终止反应。保存液（1%乙酸）4℃冰箱保存凝胶。双向电泳凝胶用GS-800Calibrated Densitometer图像扫描仪透射扫描，将扫描后的图像采用PDQuest8.0双向凝胶软件分析。

三、统计学分析

采用SPSS19.0软件进行数据统计分析，各组数据采用均数±标准差（±s）表示，两组结果比较采用方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

一、两组精液分析的比较

根据新编写的第五版《世界卫生组织人类精液分析实验室技术手册》（WHO诊断标准）[7]，采用CASA分析精液结果见表1。两组精液精子密度无统计学差异（P＞0.05），精子活力有统计学差异（P＜0.05）。

二、精子蛋白2-DE图谱的建立

我们采取clean-up kit法对样品进行预处理，选取pH5-8的固相化pH梯度胶条，采用250μg的上样量有效的分离了精子蛋白，凝胶背景干净，蛋白点分布均匀、清晰，横条纹较少，图谱质量较好。经图像分析软件PDQuest8.0分析，发现正常生育男性组与VC不育组图谱平均蛋白质点数分别为：889±26个和（857±16）个，其匹配率分别达77.9%和78.9%。蛋白质点主要分布在等电点5～7之间，相对分子质量为14～97kD。两组图谱在等电聚焦方向上的平均偏差分别为（0.78±0.14）mm和（0.82±0.16）mm，在SDSPAGE电泳方向上的平均偏差分别为（1.13±0.18）mm和（1.02±0.21）mm。以上结果表明我们已建立了分辨率高、重复性好的精子蛋白2-DE图谱（图1）。

表1 正常生育组与VC不育组精液分析结果的比较（±s）

表1 正常生育组与VC不育组精液分析结果的比较（±s）

注:*与对照组比较,P＜0.05

精子参数 正常生育男性 VC不育患者P值(n=10) (n=25)精子密度(106/mL) 27.50±4.92 25.60±6.57 0.361前向运动精子(%) 38.80±5.92 20.20±6.92*0.000

图1 正常生育男性与VC不育患者精子蛋白2-DE图谱

三、2-DE图谱中的特点和差异蛋白点分析

将两组2-DE图谱上的蛋白质点进行匹配分析，发现两组中存在差异表达的蛋白36个。与正常生育男性组相比，VC不育组有11个蛋白点表达上调（相差两倍以上），19个蛋白点表达下调（相差两倍以上）。另外有2个蛋白点在VC不育组中特异表达，4个蛋白点在正常生育男性组中特异表达。特异表达的差异蛋白点放大图谱见图2，等电点和分子量见表2。

表2 特异表达蛋白质的等电点和分子量

图2 两组特异表达蛋白质点的放大图谱

讨 论

VC是青年男性泌尿科常见疾病，1880年英国外科医生Barfield首先报道了VC可导致不育。国外学者报道VC在原发性不育男性中发病率为30%～35%，继发性不育男性中发病率为69%～81%[8,9]。国内报告约21%～41%的VC患者因不育就诊[10]，进一步研究表明随着VC程度加重，患者精液参数异常更加明显[11]。目前对于VC致男性不育的机制已进行了不少研究，但其发病机制至今仍未完全清楚，可能是通过睾丸微循环、血管活性物质、氧自由基、缺氧、一氧化氮、免疫及凋亡等多种途径共同作用[12-14]。VC与所有疾病的发生一样，都会在蛋白质水平出现与疾病相关的蛋白质表达异常，而且这种变化必然涉及到许多蛋白质及蛋白质之间的相互作用网络。以往的研究大多停留在基因水平，而且仅研究单个或者少数几个分子的作用，在蛋白质水平上缺乏系统性的整体研究。我们前期研究已经发现VC不育患者与正常成人精浆蛋白表达存在差异，提示VC导致不育可能与这些蛋白的表达或修饰改变相关[15]。

比较蛋白质组学即通过比较分析不同条件蛋白质组的差异表达，着眼发现和鉴定出有差异的蛋白质或蛋白质群。目前，比较蛋白质组学已经被广泛应用于寻找新的药物治疗靶点、研究发病机制等方面。采用2-DE结合生物质谱分析技术，从比较蛋白质组的角度对VC不育患者精子蛋白质进行研究，有可能发现与VC致男性不育的相关蛋白，可以为研究VC致男性不育的病理机制提供有益线索。同时，新发现的蛋白有可能成为男性不育的治疗靶点。因此，采用比较蛋白质组技术研究VC致男性不育的病理机制具有重要意义。

本实验采用比较蛋白质学的研究思路，以正常生育男性与VC不育患者为研究对象，比较两组精子蛋白组的差异，寻找VC引发男性不育的相关蛋白。分析双向电泳图谱表明：两组共有36个差异点，其中在VC不育组有11个表达上调，19个表达下调，2个蛋白点在VC不育组中特异表达，4个蛋白点在正常生育男性组中特异表达。这些实验结果显示，两组在蛋白质水平上存在明显差异，同时提示VC引发男性不育不仅涉及少数的几种蛋白质，而是大量蛋白质相互作用的结果。那些在VC不育组中低表达的蛋白质可能是男性生育的必须蛋白，而高表达的蛋白质可能起着干扰生育某个环节的作用。目前这些差异蛋白质的基本属性如等电点和分子量已经初步明确，尚需要进行质谱测序鉴定，并了解其生物学功能和结构，为进一步探索VC引发男性不育的分子机理奠定基础。

1 Masson P, Brannigan RE. The varicocele.Urol Clin North Am2014; 41(1):129-144

2 French DB, Desai NR, Agarwal A. Varicocele repair: does it still have a role in infertility treatment?Curr Opin Obstet Gynecol2008; 20(3): 269-274

3 Jarow JP. Effects of varicocele on male fertility.Hum Reprod Update2001; 7(1): 59-64

4 Marte B. Nature insight: proteomics. 2003; 422: 191-193

5 Gorg A, Weiss W, Dunn MJ. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.Proteomics2004; 4(12): 3665-36856 Mengual L, Ballesca JL, Ascaso C,et al.Marked differences in protamine content and P1/P2 ratios in sperm cells from percoll fractions between patients and controls.J Androl2003; 24(3):438-447

7 World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen: World Health Organization; 2010.

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10 吴阶平. 吴阶平泌尿外科学(下卷). 济南: 山东科学技术出版社, 2008: 1951-1953

11 徐军红, 胡海翔, 董静, 等. 精索静脉曲张程度对精液参数及性激素的影响.白求恩军医学院学报 2008; (5): 275-276

12 Muratorio C, Meunier M, Sonigo C,et al.[Varicocele and infertility: where do we stand in 2013?].Gynecol Obstet Fertil2013; 41(11): 660-666.

13 Walczak-Jedrzejowska R, Wolski JK, Slowikowska-Hilczer J. The role of oxidative stress and antioxidants in male fertility.Cent European J Urol2013; 66(1): 60-67

14 Chang FW, Sun GH, Cheng YY,et al.Effects of varicocele upon the expression of apoptosis-related proteins.Andrologia2010; 42(4): 225-230

15 李杰, 唐伟, 唐亚雄. 双向电泳分析精索静脉曲张不育患者精浆蛋白质的表达差异. 重庆医科大学学报 2009; 34(4): 442-446

（2014-03-25收稿）

Differential expression analysis of sperm proteins in infertile men with varicocele using two-dimensional gel electrophoresis

He Ben1, Li Qiang1*, Zhuo Hui1, Tang Wei2, Yang Minmei31. Department of Urology, the Second Aff liated Hospital of Chengdu, Chongqing Medical University/the Third Peoples Hospital of Chengdu, Chengdu, China; 2. Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University; 3.Department of Cardiology, Sichuan Provincial Hospital of Integrative of Traditional Chinese and Western Medicine

Li Qiang, E-mail: cdlql2002@yahoo.com.cn

ObjectiveTo study the differential expression of sperm proteins between fertile men and infertile men with varicocele(VC).MethodsSperm samples were analyzed by computer-assisted semen analysis system. Sperm proteins were extracted by percoll density gradient centrifugation, and the separation of total proteins was performed by two-dimensional electrophoresis(2-DE). The differentially expressed proteins of two groups were analyzed with PDQuest software.ResultsThe sperm motility in infertile men with VC demonstrated a signif cant decrease compared with the fertile men(P<0.05), and there was no signif cant difference between two groups in sperm concentration(P>0.05). Protein prof le of sperm was acquired with clear background, high resolution and better reproduction.Total of 36 different proteins were found, including 11 upregulated protein and 19 downregulated proteins in infertile men with VC group, and two proteins only expressed in infertile men with VC group, the other four proteins only expressed in fertile men group.ConclusionThere are differential expression of sperm proteins between fertile men and infertile men with VC. Differential proteins analysis will be helpful to explore the molecular mechanism of VC-associated male infertility.

spermatozoa; proteins; varicocele; electrophoresis, gel, two-dimensional; proteomics

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.005

R697+. 24

*通讯作者, E-mail: cdlql2002@yahoo.com.cn