比格犬雌激素β受体RNA干扰实验细胞及PCR检测引物的筛选

钟 睿，甘 艺，赵彦斌，刘 冰，孙兆增，朱宇旌，栾新红，胡仲明，张 勇，曾 林

（1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳 110866；2.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071；3.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

比格犬雌激素β受体RNA干扰实验细胞及PCR检测引物的筛选

钟 睿1，2，甘 艺3，2，赵彦斌2，刘 冰2，孙兆增2，朱宇旌1，栾新红1，胡仲明2，张 勇1，曾 林2

（1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳 110866；2.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071；3.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

目的筛选用于比格犬ERβ基因RNA干扰实验的细胞和检测所用引物。方法根据比格犬ERβ氨基末端区域和DNA结合区设计三对引物，用阳性质粒筛选最佳引物应用于RNA干扰效果检测，并利用293T、Hela和vero细胞的cDNA验证该引物的特异性。对这三种细胞内人ERβ基因的存在情况也进行了检测。结果经过三次重复性实验之后，结果显示引物C36684扩增效率高，且没有非特异条带，该引物对293T、Hela和vero细胞cDNA扩增时同样没有非特异性条带，但293T细胞中存在人的ERβ基因。结论引物C36684用于检测RNA干扰效率，而Hela细胞则作为RNA干扰实验的细胞工具。

ERβ基因；比格犬；筛选引物；细胞

比格犬广泛的应用于各种医学科研，是国内外公认的实验犬［1］。近几年，对比格犬生殖调控机理和技术的研究已成为国内外的热点研究问题之一［2］。近来发现比格犬种群中存在不发情或者发情不孕这样的情况，影响着比格犬的生产［3］。对于发情这一生理现象，主要受下丘脑-垂体-性腺轴来调控，其在雌激素的调节上也起着重要的作用，ERβ是目前普遍存在于动物体内的参与生殖调控的基因，不过对于ERβ是如何参与调控过程的还不是很清楚，在生殖过程中各种参与调控的基因之间的关系研究的也不是很透彻，ERβ较另一种调控生殖的基因ERα的发现晚了一段时间，不过有资料显示ERα和ERβ这两种雌激素受体序列同源性很高，对E2也有着相似的亲和性并结合着相同的DNA反应元件［4］，二者的主要差异在氨基末端区域，因此本实验主要针对ERβ的氨基末端设计引物。

本课题组前期已经通过克隆获得比格犬ERβ基因，也构建了重组真核质粒pEGFP-N1-ERβ，但是还要继续深入的研究ERβ基因的功能，需通过更为先进的实验技术来探究，RNA干扰技术就是一项目前应用较为普遍的探究基因功能的技术之一，因此本课题组拟通过应用RNA干扰技术来深入探究ERβ基因的功能，但是应用RNA干扰技术，就要检测干扰效率，还要应用细胞在体外筛选出干扰效果最佳的干扰序列，进而对比格犬进行基因沉默实验，从而探究ERβ基因的功能，如果细胞中存在ERβ基因，无疑会干扰实验结果，而且还要从转染效率，细胞活率等因素综合考虑应用于RNA干扰实验中的细胞，为解决这些问题，本实验需筛选出应用于检测RNA干扰效率的PCR引物，再筛选出应用于RNA干扰实验的最佳细胞。

1 材料和方法

1.1 材料

ERβ基因来源于本课题组前期实验人员构建的pEGFP-N1-ERβ重组质粒。293T、hela和vero细胞为本室冻存细胞。DMEM（Dulbecco's modified Eagle's）培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶购自Hyclone公司［5］。LA Taq、dNTP购自TaKaRa公司。TRIZOL购自Invitrogen公司。DEPC购自Promega公司。反转录试剂盒ReverTra Ace购自TOYOBO公司。氯仿、异丙醇等试剂为国产分析纯试剂，均购自军事医学科学院条件处。

1.2 方法

1.2.1 比格犬ERβ基因引物设计：第一对引物上游C36684：5'-tattccgccgtgaccttctat-3'，下游C36685：5'-cagctcttgcgtcgattcttat-3'，扩增片段长度为476bp；第二对引物上游C36686：5'-aatattccgccgtgaccttcta-3'，下游C36687：5'-ggccttacatccttcacacgac-3'，扩增片段长度为389bp；第三对引物上游C36688：5'-ccttagccatccattgccagtc-3'，下游同第一对引物，扩增片段长度为340bp。引物送至博迈德生物有限公司合成。

1.2.2 比格犬ERβ基因引物有效性检测：采用梯度PCR法用1.2.1中设计的三对引物扩增pEGFPN1-ERβ，梯度PCR每孔对应的退火温度为52.0℃、52.2℃、52.5℃、53.0℃、53.7℃、54.6℃、55.6℃、56.5℃、57.1℃、57.6℃、57.9℃、58.0℃，PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；梯度52℃～58℃退火30s；72℃延伸2min；经过33个循环之后，72℃延伸8min；4℃ forever，根据扩增结果选出最佳引物以及最佳退火温度。

1.2.3 比格犬ERβ基因引物特异性检测：采用Trizol一步法提取三种细胞的RNA后反转录，反转录步骤如下：65℃变性5min，置于冰上；42℃ 60min，99℃5min，4℃5min。得到的cDNA进一步进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56.5℃退火30s；72℃延伸2min；经过33个循环之后，72℃延伸8min；4℃forever，反应结束后采用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 检测细胞内人ERβ基因的存在情况：人ERβ基因引物上游C42846：5'-cacctgggcacctttctccttt ag-3'，下游C42847：5'-gcagcagctcccgcactcg-3'，如

1.2.3中获得细胞cDNA后进行PCR反应，反应程序亦同1.2.3，反应结束后采用琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 引物有效性检测结果

用三对引物对pEGFP-N1-ERβ质粒进行三次重复性扩增之后，结果均显示引物C36684扩增效果最佳，现就其中一组实验结果做分析。如图1A所示，条带均清晰，但在2 000bp之上有不是很明显的非特异性扩增带，第5条带非特异带最不明显，效果最好。图1B条带较清晰，但在250bp和750bp处有非特异性扩增条带。图1C条带模糊。因此选用C36684作为PCR检测RNA干扰效果的最佳引物，最佳温度选为56.5℃。

2.2 引物特异性检测结果

得到三种细胞cDNA后，亦用引物C36684经过三次反复扩增，结果显示三种细胞内没有ERβ基因。选出其中一组结果，即图2所示结果，三种细胞中均未扩增出比格犬ERβ基因，说明C36684具有良好的特异性。

2.3 检测细胞内人ERβ基因的存在情况结果

人ERβ基因与犬ERβ基因享有着高度同源性，如果细胞内存在人ERβ基因，仍会影响实验结果，因此用引物C42846扩增三种细胞cDNA，同样经过三次重复性试验后，选出其中一组实验结果，即如图3所示，293T细胞内存在人ERβ基因，hela和vero内不存在人ERβ基因，也就说293T细胞内存在ERβ基因的干扰，不能选用其作为细胞工具。

M：DL2000 DNA分子量标准；A：C36684扩增结果；B：C36686扩增结果；C：C36688扩增结果；阴性对照：扩增模板为ddH2O。图1 三对引物扩增pEGFP-N1-ERβ质粒鉴定结果M：DL2000 DNA molecular standard；A：Result of amplification by C36684；B：Result of amplification by C36686；C：Result of amplification by C36688；Negative control：The template.Fig.1 Identification of pEGFP-N1-ERβ plasmids amplified by the three primers

M：DL2000 DNA分子量标准；1、9、17：阳性对照，扩增模板为pEGFP-N1-ERβ；2、10、18：阴性对照，扩增模板为ddH2O；3～8：扩增模板为293T细胞六组样品；11～16：扩增模板为hela细胞六组样品；19～24：扩增模板为vero细胞六组样品。图2 三种细胞cDNA扩增结果M：DL2000 DNA molecular standard；1，9，17：Positive control，the template was pEGFP-N1-ERβ；2，10，18：Negative control，the template was ddH2O；3-8：The templates were six samples from 293T cells；11-16：The templates were six samples from Hela cells；19-24：The templates were six samples from Vero cells.Fig.2 The results of amplification of cDNA from the three cell lines

M：DL2000 DNA分子量标准；1～6：扩增模板为hela细胞六组样品；7、16、25：C36684引物扩增pEGFP-N1-ERβ；8、17、26：C42846引物扩增pEGFP-N1-ERβ；9、18、27：阴性对照；10～15：扩增模板为293T细胞六组样品；19～24：扩增模板为vero细胞六组样品。图3 hERβ引物扩增三种细胞cDNA结果M：DL2000 DNA molecular standard；1-6：The templates were six samples from Hela cells；7，16，25：Amplified pEGFP-N1-ERβ by C36684 primers；8，17，26：Amplified pEGFP-N1-ERβ by C42846 primers；9，18，27：Negative control；10-15：The templates were six samples from 293T cells；19-24：The templates were six samples from Vero cells.Fig.3 Results of cDNA amplification from the three cell lines by hERβ primers

3 讨论

前言已经提到ERα和ERβ仅在氨基末端区域有主要差异，因此需要针对氨基末端设计引物以显示ERβ的特异性。ERβ的氨基末端为12～124aa，共编码339bp，这339bp经DNA STAR软件分析后没有特异性的引物序列，理论与实际发生了碰撞，因此，又把设计区域扩大到DNA结合区，ERβ的DNA结合区为144～225aa，共编码246bp。把编码ERβ氨基末端与DNA结合区序列经DNA STAR软件分析后得出该实验中的三对特异性引物序列。

本实验所涉及的三种细胞，293T细胞为293细胞派生，为人肾上皮细胞系，Hela细胞源自一位美国妇女海莉耶塔·拉克斯子宫颈癌细胞的细胞系，而Vero细胞为非洲绿猴肾细胞。在NCBI上获取人（Gene ID：34193698）和猴（Gene ID：402766370）的ERβ基因，检索结果显示NCBI上没有非洲绿猴的ERβ基因序列，所查猴源ERβ序列为恒河猴的ERβ序列。经DNA STAR软件分析后，人与犬ERβ序列同源性为87.3％，这可以从本实验图3中用人ERβ基因的引物扩增出犬ERβ基因所证实，犬与猴的序列同源性为87.8％，人与猴的序列同源性为95.3％，分析结果显示人、犬、猴的ERβ序列同源性很高，但本实验并没有从293T、Hela和Vero细胞中扩增出比格犬ERβ基因，恰好证明了引物特异性强，不过也可能由于扩增的特定序列差异显著，还有可能是ERβ不影响肾的结构和功能，有资料显示，ERβ基因在免疫、骨骼、心血管和中枢神经系统方面有着不同的非冗余的作用［6］，还有资料显示，雌激素是一种形态发生素，其在形态发生上的作用是在ERβ基因敲除鼠的子宫［7］、卵巢［7］、乳腺［7］、前列腺［8］、肺［9］和脑［10］的结构上所证实的。但本实验并没有从Hela细胞内扩增出ERβ基因，不知道怎样解释这一科学现象，可是本实验却证实293T细胞内有ERβ基因，这又怎么解释呢?在2001年对于小鼠大脑ERβ的研究表明ERβ对神经元复苏的影响作用追溯到胚胎期的第15天。对于子宫、阴道、前列腺及肺而言，在胚胎期的第9～16天是雌激素使雄性化的影响的第一个关键阶段。第二个关键阶段为产后的1～6d，这一阶段是前列腺及骨骼形成阶段［4］，虽然没有直接说明为什么293T细胞内会有ERβ基因，不过从侧面证实ERβ基因在胚胎时期起作用，因此293T细胞内有ERβ基因也不足为奇。既然293T细胞内存在ERβ基因，而人与犬ERβ基因同源性有很高，所以293T细胞不能用在后续RNA干扰实验中。那么就从Hela细胞和Vero细胞中择一。由于Hela细胞可以无限分裂并且转染效率高，因此本实验选用Hela细胞作为后续RNA干扰实验的细胞工具。

［1］孙兆增，曾林，洪宝庆，等.乙烯雌酚对间情期比格犬发情的诱导［J］.中国比较医学杂志，2008，18（11）：36-38.

［2］任秀梅，赵彦斌，胡仲明，等.比格犬一种新雌激素β受体可变剪切体的克隆及鉴定［J］.中国比较医学杂志，2012，22（7）：36-39.

［3］许琴，赵彦斌，胡仲明，等.间情期与发情期比格犬子宫与卵巢组织形态学的比较［J］.中国比较医学杂志，2012，22（7）：44-47.

［4］Heldring N，Pike A，Andersson S，et al.Estrogen receptors：how do they signal and what are their targets［J］.Physiol Rev，2007，87：905-931.

［5］曹玉华，严翔，刘一，等.棕头蜘蛛猴Atfu-B基因α2结构域缺失剪切异构体的表达及其细胞内定位［J］.中国比较医学杂志，2013，23（10）：63-66.

［6］Harris H.Estrogen receptor-beta：recent lessons from in vivo studies［J］.Mol Endocrinol，2007，21（1）：1-13.

［7］Förster C，Mäkela S，Wärri A，et al.Involvement of estrogen receptor β in terminal differentiation of mammary gland epithelium［J］.Proc Nat Acad Sci U S A，2002，99（24）：15578-15583.

［8］Weihua Z，Malela S，Andersson LC，et al.A Role for estrogen receptor beta in the regulation of growth of the ventral prostate［J］.Proc Nati Acad Sci U S A，2001，98（11）：6330-6335.

［9］Morani ABR，Imamov O，Hultenby K，et al.Lung dysfunction causes systemic hypoxia in estrogen-receptor beta knockout mice［J］.Proc Nati Acad Sci U S A，2006，103（18）：7165-7169.

［10］Wang L，Andersson S，Warner M，et al.Morphological abnormalities in the brains of estrogen receptor beta knockout mice［J］.Proc Nati Acad Sci U S A，2001，98（5）：2792-2796.

PCR primers and cell screening for the RNA interference of estrogen receptor beta in Beagles

ZHONG Rui1，2，GAN Yi3，2，ZHAO Yan-bin2，LIU Bing2，SUN Zhao-zeng2，ZHU Yu-jing1，LUAN Xin-hong1，HU Zhong-ming2，ZHANG Yong1，ZENG Lin2
（1.College of Veterinary and Animal Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；2.Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071；3.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

ObjectiveTo screen the cells and construct primers to be used for RNA interference experiment of ERβ gene in Beagles.MethodsThree pairs of primers were designed according to the amino terminal and DNA binding area of ERβ gene in Beagles，and the best primers were screened as the primers to be used to detect RNA interference effect by positive plasmid，and the cDNA from 293T，Hela and Vero cells was used to validate the specificity of the primers.The existence of homo ERβ gene was also tested in the three cell types.ResultsAfter experiments repeated for three times，the results showed that they had high amplification effect and there was no nonspecific amplification by the C36684 primers.The amplification results of cDNA from 293T，Hela and Vero cells also showed that there was no nonspecific amplification by the primers，but there was homo ERβ gene expression in 293T cells.Conclusion The C36684 primer pair is selectedfor detecting RNA interference effect，and Hela cells are selected as the tool for RNA interference experiment.

ERβ gene；Beagles；Screening primers；Cells

R33

A

1671-7856（2014）02-0042-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.010

国家自然科学基金资助项目31172164。

钟睿（1987-）女，硕士生，动物营养与饲料科学专业。

曾林（1965-），男，博士生导师，实验动物科学与管理；张勇（1972-），男，硕士生导师，分子营养学、饲料生物技术。

2013-11-25