紫外与亚硝基胍复合诱变选育高产多糖罗耳阿太菌

李鸿梅，苗琇岩，魏 明，赵 慧，闵伟红

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118）

罗耳阿太菌（Athelia rolfsii）属半知菌亚门小菌核属，有性世代为齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）[1-2]。该菌所分泌的多糖具有优良的增稠性[3]、假塑性[4]、抗菌性[5]、抗肿瘤活性、免疫活性[6]，广泛应用于食品[7]、药品、陶瓷、石油等领域[8]。目前，德国Cargill公司、美国Pillshury公司已有小菌核属多糖工业化产品，而我国对该多糖的需求主要依赖进口，主要原因是缺乏高产多糖的优良菌株。

诱变是改良菌种的基本方法。常用诱变方法包括物理诱变（如紫外线、X射线、γ射线、快中子）和化学诱变（如碱基类似物诱变剂、移码突变剂、烷化剂等）[9]。由于单独使用一种诱变方法，诱变效率低，且易发生回复突变。目前国内外学者通常采用紫外线或亚硝基胍诱变方法改良真菌菌种[10]。1976年，小菌核属多糖由法国CECA S.E.公司商业化，商品名为Biopolymer CS，随后法国赛诺菲生物公司收购了CECA S.E.公司，成为国际上生产小菌核属多糖的主要生产者，并为该种多糖取商业名为Polytran[11]。目前我国还没有该多糖的工业化产品，而且缺乏对罗耳阿太菌及其相近菌属的菌种改良研究工作。本文通过响应面设计紫外线（UV）和亚硝基胍（NTG）复合诱变罗耳阿太菌，根据目标致死率优化诱变条件，获得高产多糖的正向突变菌株，提高多糖产量[12]，为该多糖在国内的工业化生产奠定一定的科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗耳阿太菌（Sclerotium rolfsii） 吉林农业大学发酵实验室保藏菌种；亚硝基胍（NTG）溶液 称取10mg亚硝基胍于棕色瓶中，加1.0mL丙酮使其溶解，溶解后加10mL水，配制成1.0mg/mL亚硝基胍溶液[12-13]；PBS溶液 称7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4、1.8g K2HPO4，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调pH至7.4，用蒸馏水定容至1L，保存于4℃冰箱中备用；PDA斜面培养基（g/L） 马铃薯200、葡萄糖20、琼脂20，pH自然；种子培养基（g/L） 葡萄糖30.0、NaNO33.0、KH2PO41.0、酵母浸粉1.0、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5，pH4.0；发酵基础培养基（g/L） 葡萄糖35.0、NaNO33.0、KH2PO41.0、酵母浸粉1.0、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、柠檬酸1.4，pH4.5。

HZC-Q空气浴振荡器 哈尔滨市东联技术开发有限公司；HPX-9082 MBE数显电热培养箱 上海博迅实业有限公司；pH计 上海雷兹仪器厂；高速低温离心机Z-36HK 德国HERMLE；HH-8水浴锅 国华电器有限公司；MP6001电子天平 上海恒平有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种选育程序 出发菌株→制备菌丝体悬液→稀释→诱变处理→涂平板→挑取单菌落斜面培养→摇瓶复筛→测定多糖产量。

1.2.2 培养条件 菌种斜面活化：29℃培养3d。种子摇瓶培养：100mL种子液，29℃，200r/min，2d。发酵摇瓶培养：100mL发酵液，接种量7%，29℃，200r/min，5.5d。

1.2.3 多糖提取 向培养结束的液体培养基中加3倍体积蒸馏水，用1mol/L NaOH调pH为7.0，80℃水浴处理40min，8000r/min离心30min，取300mL上清液，加入等体积95%乙醇，4℃静置醇沉8h，5000r/min离心20min，取沉淀80℃烘干至恒重，称量。

1.2.4 诱变方法

1.2.4.1 紫外诱变 将斜面培养基保存的菌种接种到种子培养液中，29℃下培养24h，匀浆，稀释至10-3，转移到培养皿中，在15W紫外灯下20cm处照射30s（紫外灯预热30min），取0.1mL菌液涂平板。将平板置于29℃的恒温培养箱中避光培养3d，计算致死率：

式中，S1—诱变处理前菌落面积；S2—诱变处理后菌落面积。

按上述方法固定其他因素，选择紫外照射时间为20、30、40、50、60、70s，菌液稀释梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，培养时间为12、18、24、30、36h，分别进行单因素实验。在突变株中选取7个长势较好的菌株，分别命名UV1、UV2、UV3、UV4、UV5、UV6、UV7，进行发酵培养，提取并测定多糖产量。

1.2.4.2 亚硝基胍（NTG）诱变 将斜面培养基保存的菌种接种到种子培养液中，29℃培养24h，8000r/min离心10min，收集菌丝体，用PBS冲洗1次，加入0.5mL PBS制成菌丝体悬液，加入0.4mg/mL NTG溶液0.5mL，29℃处理40min后离心，用PBS冲洗菌丝体沉淀3次，除去残留的NTG，转移至100mL种子培养基中29℃培养2d，匀浆振荡2min，稀释10-3，涂平板，29℃培养3d，计算致死率。

按上述方法固定其他因素，选择亚硝基胍浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/mL，诱变时间10、20、30、40、50、60min，分别进行单因素实验。根据单因素实验结果选择亚硝基胍诱变条件为：亚硝基胍浓度0.4mg/mL，亚硝基胍处理时间40min，进行亚硝基胍诱变。在突变株中选取7个长势较好的菌株，分别命名为NTG1、NTG2、NTG3、NTG4、NTG5、NTG6、NTG7，进行发酵培养，提取并测定多糖产量。

1.2.4.3 紫外线与亚硝基胍复合诱变 将斜面培养基保存的菌种接种到种子培养液中，29℃培养24h，匀浆，稀释10-3。15W紫外灯下20cm处照射菌丝体悬浮液一段时间（响应面设计），8000r/min离心10min，收集菌丝体，用PBS冲洗1次，加入0.5mL PBS制成菌丝体悬液，加入一定浓度的NTG（响应面设计），浸泡紫外诱变后的菌丝体，29℃诱变处理一段时间（响应面设计）后离心，离心后用PBS冲洗菌丝体沉淀3次，除去残留的NTG，转移菌丝体至100mL种子培养基中，29℃下培养2d，匀浆，稀释10-3，涂平板，29℃培养3d，计算致死率。从平板上随机选取16个长势较好的菌株，进行发酵培养，提取并测定多糖产量。

1.2.4.4 响应面实验设计复合诱变 紫外与亚硝基胍复合诱变响应面设计因素见表1。

表1 紫外与亚硝基胍复合诱变响应面因素表Table 1 Response surface factors and levels on UV and NTG mutagenize

1.2.5 遗传稳定性实验 选取诱变后得到的多糖产量较高的变异菌株连续传代5次，每代分别进行摇瓶发酵培养，提取并测定多糖产量。

2 结果与分析

2.1 紫外（UV）诱变

2.1.1 紫外照射时间对致死率的影响 按1.2.4.1采用不同的照射时间对菌体进行处理，以未经紫外照射的菌株为对照，计算致死率，结果见图1。由图1可知，随照射时间的延长，致死率逐渐增加。较高的诱变指标（致死率）有利于筛选优良菌株，但由于紫外线有杀菌的效果，如果处理时间过长，一些高活性菌株也可能致死，不利于筛选。因此，选择70%～80%为目的致死率。从图1中可看出当处理时间为50s时，致死率达71.65%，因此选取50s为紫外照射时间。

图1 照射时间对UV诱变致死率的影响Fig.1 Effect of UV radiation time on lethality rate

2.1.2 菌液稀释梯度对致死率的影响 稀释梯度对致死率的影响见图2，从图2中可以明显看出，菌液稀释梯度对致死率影响较大。当稀释梯度为10-1时，紫外诱变致死率较低，仅为17.32%，这可能是由于菌丝体密度过大影响了紫外线的穿透能力，使诱变效果不明显；随着菌液浓度的增大，紫外线的穿透能力随之增强，菌种致死率明显增加。但是菌液浓度过低时，菌丝体含量较少，紫外线穿透量过大，紫外照射会杀死大量菌体，所以当稀释梯度为10-5时，致死率接近100%。稀释梯度为10-3时，致死率为68.32%，接近目标致死率。因此，稀释梯度选择为10-3。

图2 菌液稀释梯度对UV诱变致死率的影响Fig.2 Effect of diluted Athelia rolfsii liquid gradient on lethality rate by UV

2.1.3 种子培养基培养时间对致死率的影响 选择种子培养基中培养不同时间的菌种进行紫外诱变，致死率结果见图3。从图3中可以看出，在种子培养基中培养12h时的菌种经紫外照射后，在平板培养基中基本没有菌落出现，这可能是由于经过12h的培养，菌种生长还停留在适应期，紫外照射引起成大量菌种死亡；而经过种子培养基培养36h的菌种，紫外诱变后致死率仅为34.79%，可能是由于菌体生长处于对数期末期或稳定期，此期间菌体生长状况基本稳定，紫外照射诱变后的菌种致死率较低。培养24h的菌种经紫外诱变后致死率为74.68%，符合目的致死率。因此，选择培养24h的菌种进行紫外诱变处理。

图3 种子培养时间对UV诱变致死率的影响Fig.3 Effect of Athelia rolfsii incubation time in seed culture medium on lethality rate by UV

2.1.4 紫外诱变对多糖产量的影响 紫外诱变对多糖产量的影响如图4所示，采用单因素实验获得的最佳条件（紫外照射时间50s、稀释梯度10-3、培养时间24h）对罗耳阿太菌进行紫外诱变，突变株多糖产量有明显变化。正向突变株多糖产量明显增加，其中UV1、UV2、UV6和UV7多糖产量相对出发菌株增长率均高于10%。UV7多糖产量最高，达17.759g/L，比出发菌株16.042g/L增长了10.70%。

图4 紫外诱变菌株的多糖产量Fig.4 Polysaccharide production from different mutant strains treated by UV

2.2 亚硝基胍诱变

2.2.1 亚硝基胍浓度对致死率的影响 亚硝基胍是有效的化学诱变剂，可以使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，导致DNA复制时碱基配对错误而引起突变。不同浓度亚硝基胍诱变菌体所得致死率结果见图5，亚硝基胍浓度为0.1mg/mL时，致死率仅为13.16%。随着亚硝基胍浓度的增加，致死率明显升高，当亚硝基胍浓度达到0.4mg/mL时，致死率为71.35%，在目标致死范围之内。继续提高亚硝基胍浓度，菌体致死率迅速提高，浓度为0.6mg/mL时，菌体基本完全死亡。所以在亚硝基胍诱变中选择亚硝基胍浓度为0.4mg/mL。

图5 亚硝基胍浓度对致死率的影响Fig.5 Effect of NTG concentration on lethality rate

图6 亚硝基胍处理时间对致死率的影响Fig.6 Effect of treated time by NTG on lethality rate

2.2.2 亚硝基胍处理时间对致死率的影响 一般来说，延长亚硝基胍的处理时间，会增大菌体DNA突变的几率，从而提高致死率。真菌诱变致死率一般要求控制在70%～80%之间，为了获得这样高的致死率，通常控制亚硝基胍的处理时间在20～70min之间。亚硝基胍诱变时间对菌体致死率的影响结果见图6。由图6可知，亚硝基胍处理10min，菌体的致死率为26.32%；随着诱变时间的增加，菌体致死率显著提高。诱变时间为40min时，致死率达到79.65%，在目标致死范围之内。诱变时间为60min时，菌体基本死亡。因此在亚硝基胍诱变中处理时间选择40min。

2.2.3 亚硝基胍诱变对多糖产量的影响 亚硝基胍诱变对多糖产量的影响如图7所示，采用单因素实验获得的最佳条件（亚硝基胍浓度0.4mg/mL，亚硝基胍处理时间40min）对罗耳阿太菌进行亚硝基胍诱变，突变株多糖产量有明显变化。正向突变株多糖产量明显增加，其中NTG1、NTG2、NTG5和NTG7多糖产量相对于出发菌株增长率均高于14%。其中NTG7多糖产量最高，达18.573g/L，比出发菌株16.042g/L增长了15.78%。

图7 亚硝基胍诱变突变株的多糖产量Fig.7 Polysaccharide production from different mutant strains treated by NTG

2.3 紫外与亚硝基胍复合诱变

2.3.1 复合诱变条件 根据表1进行紫外与亚硝基胍复合诱变，实验结果见表2，响应面结果分析、回归模型参数方差分析见表3。

以致死率为响应值回归拟合所得各因素函数表达如下：Y=79.20+4.40A+13.35B+4.03C-7.03AB-0.23AC-3.32BC-0.63A2-1.64B2+3.62C2。

由方差分析得出p值，模型极显著，模型的失拟性不显著，回归决定系数R2=0.9897，修正决定系数R2Adj=0.9764，说明方程拟合性较好，可对培养条件分析预测。采用Design Expert 8.0.5对结果分析，目标致死率选择75%，确定复合条件见表4。

2.3.2 复合诱变对多糖产量的影响 按表4中修正条件对罗耳阿太菌进行复合诱变，突变株多糖产量如图8所示，每组选取四株长势较好的突变株进行发酵培养，都能筛选出正向突变菌株，其中X2、X3、X13菌株的多糖产量均达到19g/L以上。紫外照射40s，浓度为0.28mg/mL的亚硝基胍处理25min的突变菌株X2多糖产量最高，达19.868g/L，比出发菌株16.042g/L增长了23.85%。

2.4 遗传稳定性实验结果

将图8中X2突变株连续传代培养5次，发酵测定多糖产量，多糖产量遗传稳定性结果见表5。由表5可知，在几次传代中，多糖产量基本相同，均达到19.6g/L以上。对传代5次的多糖产量进行方差分析，计算方差为0.001，表明经过传代后的X2菌株多糖产量基本稳定。实验结果表明X2菌株产多糖的遗传稳定性较好。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Process variables and levels of UV and NTG in response surface central composite design and experimental results

表3 复合诱变回归模型方差分析Table 3 Variance analysis for regression model of composite mutation

图8 紫外与亚硝基胍复合诱变菌株多糖产量Fig.8 Polysaccharide production from different mutanted strains treated by UV and NTG

表4 优化复合诱变条件Table 4 Variance analysis for regression model of composite mutation

表5 突变菌株X2产多糖遗传稳定性Table 5 Stablity of polysaccharide production from X2

3 结论

分别采用紫外线和亚硝基胍诱变罗耳阿太菌，UV7突变株多糖产量为17.759g/L，NTG7突变株多糖产量为18.573g/L。紫外线和亚硝基胍复合诱变条件为：紫外照射40s，亚硝基胍浓度0.28mg/mL，亚硝基胍处理时间25min，筛选得到X2突变株，多糖产量最高为19.868g/L，比出发菌株16.042g/L增长了23.85%。以X2为出发菌株，连续传代5次，多糖产量基本一致，表明通过亚硝基胍与紫外复合诱变得到的X2菌株遗传稳定性较好。

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