益气生津活血方对链脲霉素引发糖尿病大鼠模型的心肌微血管损伤防护作用

2014-10-25 02:25宋钦兰林海青
药学研究 2014年6期
关键词:灌胃空白对照活血

宋钦兰,林海青

(山东中医药大学附属医院,山东济南250011)

糖尿病被称为冠心病的等危症,70% ~80%的患者存在心血管系统并发症,主要为心肌弥漫性小血管病变,使心肌硬度增加,弹性降低。益气生津活血方主要由肉桂、三七、红花、川芎等中药组成,具有活血、益气、生津的功效,能显著改善糖尿病病人的冠心病症状。本实验通过观察益气生津活血方药对糖尿病大鼠动物模型的影响,考察益气生津活血方治疗糖尿病大鼠并发冠心病的作用机制,为临床有效防治糖尿病并发冠心病提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物及分组 SD雄性大鼠(120±15)g 80只,购于山东中医药大学动物中心,合格证号:SCX(鲁)2011003。以上大鼠分组,分别为益气生津活血方低剂量组、益气生津活血方高剂量组、二甲双胍组、模型对照组、空白对照组、益气生津活血方预防组。

1.2 药品及试剂 白介素-1(IL-1)酶联免疫试剂盒,细胞间粘附分子(SICAM-1)酶联免疫试剂盒,内皮素-1(ET-1)放射免疫试剂盒(试剂盒均为进口分装,由迪耐商贸有限公司提供)。益气生津活血方水煎液:益气生津活血方中各味中药由山东中医药大学附属医院提供,处方剂量混合后按常规中药煎煮方法煎煮并浓缩至1 g·mL-1备用。

1.3 仪器 匀浆机(IKA),酶标仪(BIOTEK),全自动放射免疫R计数器(SN-695,上海),DD-5冷冻离心机(JOUAN),血糖仪(强生)。

2 试验方法

2.1 造模 高脂饲料+STZ法,按分组大鼠适应环境饲养7天,空白对照组大鼠用普通饲料。其他5组喂养高脂饲料,同时预防组灌胃益气生津活血方(9.09 g·kg-1)水煎液,90 d 后一次性腹腔注射STZ 15 mg·kg-1,然后继续喂养高脂饲料 20 d,然后空腹测体重和血糖,把不符合糖尿病体征大鼠剔除,每组10只。

2.2 试验方法 除空白对照组外,其余各组灌胃给药,高、低剂量(36.36、18.18 g·kg-1)分别按临床用量 2、4 倍量(计算公式为 d大鼠=0.71 k人/0.11),空白对照组用同体积蒸馏水灌胃,同时预防组继续灌胃益气生津活血方水煎液,连续灌胃12周,每7 d称一次体重,按新体重调整灌胃剂量,灌胃结束后禁食不禁水12 h,用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,腹腔静脉取血,测血糖,然后3 000 rpm离心20 min,血清-80℃保存备用。然后取大鼠心脏,一部分用冰生理盐水冲洗,在冰上沿左心室方向解剖左心室,4%多聚甲醛固定,HE染色,做病理切片。另一部分精确称重,以5 mL·g-1冰生理盐水匀浆,制备20%心肌组织浆液,然后于低温离心机上3 000 rpm离心20 min,取上清液4℃保存备用。

3 实验结果

3.1 取以上待测液,分别按 SICAM-1、IL-1、ET-1试剂盒说明书测定,所得数据经统计处理结果见表1、2。

表1 益气生津活血方对血糖的影响(±s,n=10)

表1 益气生津活血方对血糖的影响(±s,n=10)

注:与空白对照模型组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,#P<0.05

组别 动物数 造模前血糖 造模后血糖 用药后血糖空白对照组10 5.31 ±0.56 5.47 ±0.56 5.21 ±1.02低剂量组 10 5.42 ±0.59 8.17 ±1.02# 6.24 ±1.11#高剂量组 10 5.71 ±0.11 8.23 ±1.60# 6.08 ±0.93#预防组 10 5.23 ±0.61 8.30 ±2.11# 5.89 ±1.57#二甲双胍组 10 4.98 ±1.11 8.86 ±1.64# 5.77 ±1.14#模型对照组 10 6.05 ±1.32 8.11 ±1.25* 9.01 ±2.33*

表2 益气生津活血方对SICAM-1、IL-1、ET-1的影响(±s,n=10)

表2 益气生津活血方对SICAM-1、IL-1、ET-1的影响(±s,n=10)

注:与模型对照组比较,*P<0.05;模型组与空白对照模型组比较,#P<0.05

组别 动物数 SICAM-1(ng·mL -1)IL-1(pg·mL -1)ET-1(pg·mL -1)10 369.1 ±31.2 60.6 ±14.1 109.3 ±39.7预防组 10 377.4 ±21.6* 61.7 ±11.3* 112.6 ±29.5*低剂量组 10 382.3 ±27.5* 66.7 ±15.6* 127.3 ±39.3*高剂量组 10 379.1 ±31.5* 61.8 ±16.4* 119.5 ±26.7*二甲双胍组 10 379.8 ±31.7* 73.2 ±21.3* 139.6 ±21.5*模型对照组 10 495.7 ±51.1# 95.2 ±11.8# 157.7 ±26.1空白对照组#

3.2 HE染色后显微镜下观察 模型对照组可见部分心肌纤维呈灶性肥大,且有多个小空泡,细胞变宽变大,细胞核不在中间位置,偏向一侧,有的心肌横纹消失,心肌间质有纤维结缔组织样增生,二甲双胍组显微镜下观察其心肌细胞与模型对照组形状相似,但程度明显减轻,预防组与二甲双胍组显微镜下观察形状相近,程度也相近。益气生津活血方组显微镜下观察心肌细胞与模型对照组相似,程度介于模型对照组与二甲双胍组和预防组之间。各组心肌细胞显微镜下观察见图1。

4 讨论

有学者[1]认为,糖尿病早期即可出现微血管内皮功能损伤和活性物质分泌异常,其中Nishikawa T等[2]认为,高血糖可增强细胞氧化应激性,这种氧化应激能激活有关的信号传导通道,通过激活核因子(NF-KB)来上调细胞间黏附分子及炎性因子(SICAM-1、IL-1、ET-1)基因转录,通过一系列生物反应,心肌微血管内皮细胞则出现炎症反应,导致微循环障碍发生,因此糖尿病与微血管病变存在必然联系。

祖国医学认为,阴虚为糖尿病发生的实质,气虚是糖尿病不愈之症结,血瘀是糖尿病并发症的关键,阴阳两虚是糖尿病发病的趋势[3],李赛美等[4]临床研究显示,中医益气养阴、活血化瘀对糖尿病心肌缺血有一定的效果,且活血效果更佳。吴勇等[5]研究表明,黄芪多糖可降低糖尿病大鼠血糖水平,对早期糖尿病大鼠内皮细胞具有良好的保护作用。

图1 各组心肌细胞显微镜下观察照片

益气生津活血方主要由肉桂、黄芪、桂枝、仙灵脾、三七、红花、川芎、黄连、川牛膝组成,其各组分含量比是经过正交试验获得,具有活血、温养、补中益气之功效。本实验通过高脂饲料+STZ法成功造成符合临床Ⅱ糖尿病模型,给模型动物灌胃益气生津活血方,且通过实验数据分析得知,益气生津活血方能显著降低糖尿病大鼠心肌浆液SICAM-1、IL-1、ET-1含量;镜下观察,能显著降低心肌横纹消失,心肌间质纤维结缔组织样增生,显著降低心肌纤维肥大和脂肪细胞堆积。实验证明,益气生津活血方对链脲霉素引发糖尿病心肌微血管损伤具有保护作用。

[1]Suwaidi JA,Hamasaki S,Higano ST,et al.Long - term follow-up of patients with mild coronary artery disease endothelial dysfunction[J].Circulation,2000,101(9):948-954.

[2]Nishikawa T,Edelstein D,Du XL,et al.Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage[J].Nature,2000,404(6779):787-790.

[3]周鲁,周晓芳,付超,等.271首治疗糖尿病中药复方用药规律研究[J].新中医,2004,36(11):40 -41.

[4]李赛美,熊曼琪,林安钟,等.中医不同治法对糖尿病大鼠冠状动脉结扎致心肌缺血预防作用的对比观察[J].中国中西医结合杂志,2000,20(6):438 -440.

[5]吴勇,欧阳静萍,涂淑珍,等.黄芪多糖对糖尿病大鼠血管内皮细胞的影响[J].辽宁中医杂志,2002,29(1):22-23.

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