脲酶测定法判定豆浆抗营养因子热失活情况研究

林菁菁，伊娟娟，王振宇，3＊

（1.圣元国际食品营养有限公司；2.哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨 150090；3.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040）

人们把对营养物质的消化、吸收和利用产生不利影响以及使人和动物产生不良生理反应的物质，统称为抗营养因子（ANF）。大豆及其制品中含有多种抗营养因子，包括蛋白酶抑制因子、脲酶、凝集素、植酸、脂肪氧化酶等，这些抗营养因子严重阻碍了蛋白质和其它营养物质的有效利用，对食用和饲用价值均产生不利影响。生大豆中胰蛋白酶抑制因子的含量约30mg／g，它对植物本身具有保护作用，可防止大豆籽粒自身发生分解代谢，使种子处于休眠状态，能调节大豆蛋白质的合成和分解。但同时，胰蛋白酶抑制剂因子与肠内胰蛋白酶结合后随粪便排出体外，使肠内胰蛋白酶数量减少，引起胰腺反射性亢进，分泌量加大，增加内源氮损失，导致机体内含硫氨基酸的耗散性缺乏，造成体内氨基酸代谢失调或不平衡。

生大豆食入后，在胃肠内适宜的水分、温度、pH条件下被激活，激活的脲酶将大豆中部分含氮化合物分解成氨，大量氨的存在会引起机体氨代谢障碍或中毒。由于脲酶检测方法较多，检测比较容易，所以生产上常以“脲酶活性”的大小来表示大豆及大豆制品中抗营养因子的破坏程度，将脲酶作为豆粕和其他豆制品毒性甚至营养价值检测指标。

大豆加工中一些物理因素（温度、时间、压力、水分和粒度）可影响脲酶灭活程度。就毒性而言，脲酶活性越小越好，但过度加工（主要温度过高），往往导致赖氨酸、精氨酸、胱氨酸的破坏和蛋氨酸、异亮氨酸的消化率降低，使水溶性氮减少。适当的脲酶指标可成为综合评价豆粕及其他大豆制品营养价值的重要指标。

大豆中60%～80%的磷都是以植酸态存在。植酸能和饲料中的矿物质元素如铁、锌、锰等结合形成难溶的植酸盐络合物，从而导致这些必需矿物质元素的消化利用率降低。植酸能与蛋白质结合，降低其溶解性，影响蛋白质的生理功能。植酸还可与淀粉酶、胰酶和胃蛋白酶结合，抑制其活性。

大豆凝集素是一种高亲和性的糖蛋白，在动物肠道中不被蛋白酶水解，因此可与小肠壁上皮细胞表面的特异性受体结合，从而损坏小肠壁刷状缘黏膜结构，干扰消化酶的分泌，抑制肠道对营养物质的消化吸收，使蛋白质利用率下降，动物生长受阻甚至停滞。另外，凝集素的L-亚单位能特异性的与淋巴细胞结合，对肠道产生的IgA具有拮抗作用，对免疫系统有破坏作用。

脂肪氧化酶又称抗维生素因子，它在大豆蛋白中的含量比较高，约占大豆总蛋白质的2%，是一种含非血红素铁的蛋白质。该酶只要遇到水分，就能专一催化大豆中多元不饱和脂肪酸（亚油酸、亚麻酸）的加氧反应，生成的过氧化物可以破坏与其共存的维生素A、D、E、B12和胡萝卜素，生成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物，再经裂解酶分解生成短碳链的醇、酮和醛类等挥发性物质，导致产生豆腥味。另外，脂肪氧化酶氧化生成的过氧化物，可破坏脂肪中的维生素A、D、E等脂溶性维生素及胡萝卜素的活性，从而降低大豆蛋白的效价和营养价值。

豆浆作为一种优质蛋白饮品一直受到亚洲人的喜爱，但作为大豆制品的豆浆会含有一些妨碍营养物质消化、吸收和利用的抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂、脲酶、血球凝集素、胀气因子等。目前对大豆抗营养因子采用的失活方法主要是物理热处理法。由于豆浆中脲酶的测定方法多且较容易，常常通过豆浆中脲酶活性的情况来判断抗营养因子的存在与否。本研究通过测定豆浆中胰蛋白酶抑制剂和脲酶的活性研究豆浆加热过程中二者失活是否具有一致性，判定以脲酶活性来体现豆浆安全的科学性，同时通过豆浆加热程度与胰蛋白酶抑制剂失活情况的关系，对家庭豆浆制作提供一种安全的加热模式。主要目的是分析以测定脲酶的热失活是否可以判定或反应豆浆中其他抗营养因子的热失活情况，同时，寻求家庭自制豆浆煮沸的最佳时间以保证饮用安全。

加热处理对豆浆中胰蛋白酶抑制剂和脲酶失活程度的一致性研究；家庭豆浆制作加热处理方式确定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂的选择

大豆、牛胰蛋白酶、所用化学试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备的选择

LD4-2离心机、多功能恒温水浴锅HHBll-500型、紫外可见分光光度计UV-2401PC型、PHS-3C精密pH计、EST-4电子分析天、电子称量高速组织捣碎机

1.3 溶液的配制

Tris缓冲溶液；BAPNA 溶液；0.001NHCl；胰蛋白酶溶液；30%醋酸溶液；硫酸铵标准贮存液；尿素缓冲溶液（pH6.9至7.0）；25% 三氯乙酸；纳氏试剂。

1.4 基本检测方法

1.4.1 豆浆干物质含量的测定

豆浆干物质含量的测定采用重量法（GB／T 8858-1988）。

1.4.2 热处理对豆浆胰蛋白酶抑制剂和脲酶失活程度一致性研究

加热处理生豆浆，分别取加热至50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的样品，及煮沸1～6、10、15、20min的样品，测定加热前后豆浆中脲酶及胰蛋白酶抑制剂的活性及干物质含量（%），计算失活率（%）。

2 结果与讨论

2.1 硫酸铵标准曲线的绘制

以硫酸铵标准液（μmol数）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。

图1 硫酸铵标准曲线

则吸光度与摩尔数之间的关系方程为：y＝0.1488x-0.0275（R2＝0.9931）其中，y为吸光度，x为NH4＋的摩尔数。由表2可知对于家庭泡发的生豆浆在煮制过程中，随着加热温度的升高，其UA的活性呈递减趋势，且加热温度越高失活率越大；但在加热温度较低时，UA的失活程度并不明显，待到80℃后，其UA的失活程度急剧升高，90℃时，UA的失活率就已达到80%，可见脲酶对于热很不稳定，即普通加热温度便可使豆浆中的脲酶大量失活。在100℃煮沸后，豆浆中UA的活性仍随着时间的延长而降低，其失活程度十分缓慢，煮沸6min后，豆浆中脲酶的失活率就将达到90%，煮沸15min时豆浆中的脲酶就完全失活，根据QB／T2132-1995对豆乳中脲酶的定量检出量应为0mg／g即为合格，说明此时饮用豆浆相对安全，而家庭煮豆浆一般在所谓开锅几分钟后就饮用，显然豆浆中还会残存少量脲酶，对健康有一定危害。

对于家庭泡发的生豆浆在煮制过程中，随着加热温度的升高，其TIA的活性呈递减趋势，且加热温度越高失活率越大；但在未煮沸之前豆浆TIA的失活程度尚未达到一半，其失活水平处于一个很低的状态，即此时的豆浆具有很高的抗营养性，不宜饮用。当豆浆煮沸1min时，其TIA失活率仍未达到50%，但随着加热时间的延长，其失活程度开始大大加强，3～5min失活率急剧升高，6min时豆浆TIA失活率就超过80%，煮沸15min时，即在豆浆中脲酶完全失活时胰蛋白酶抑制剂仍保持一定活性，煮沸20min时TIA才完全失去活性，此时饮用豆浆才相对安全。

2.2 豆浆加热中TIA和UA的失活情况及比较

根据试验测定数据使其能更直观的看出豆浆在加热中TIA和UA的失活情况及二者的较，结果见图2、图3。

图2 不同加热温度豆浆UA、TIA失活情况及比较

图3 100℃不同加热时间豆浆UA、TIA失活情况及比较

由图2、3可明显看出在不同加热温度和煮沸时间下豆浆中TIA和UA的失活路径及二者失活情况的比较。豆浆中的UA和TIA在加热过程中均发生钝化，且存在一定的线性关系，但二者的失活路径不尽相同。

自制生豆浆在加热过程中，随着加热温度的升高其TIA、UA的失活率均呈递增趋势。TIA的失活较为平稳，而UA从加热开始到50℃失活率几乎为0，从60℃到90℃急剧失活；在70℃左右时，豆浆中的TIA和UA失活率有一个近似交点，说明此时二者对热的稳定性比较一致，且随着加热温度的升高，UA的失活率明显大于TIA。

100 ℃煮沸后，随着时间的递增，TIA的失活仍有上升趋势，3～5min失活开始加剧，5min后失活逐渐缓慢；而UA在此段时间内失活路径十分平缓，但最终豆浆在煮制后其UA的失活率仍然大于TIA，且在煮沸5min后二者的失活路径基本一致，在豆浆中UA完全失活5min后TIA才完全失活，且要完全去除豆浆中的UA和TIA需将豆浆煮沸15min和20min。

3 结论

豆浆中的脲酶和胰蛋白酶抑制剂在加热过程中均发生钝化，且存在一定的线性关系，但二者的失活路径不尽相同。在大豆加工中，以脲酶作为抗营养因子失活指标不能全面反映大豆及其制品中抗营养因子的失活状况。且从本研究中还可以得到如下结论：生豆浆高温加热是去除TIA最直接有效的方法，且要完全去除豆浆中的UA和TIA需将豆浆煮沸15和20min。故根据QB／T2132-1995对豆乳中脲酶的定量检出量的要求家庭煮制的豆浆并非安全，应适当延长其煮沸时间。

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