应用CRISPR/Cas9技术在杨树中高效敲除多个靶基因

刘婷婷，范迪，冉玲玉，姜渊忠，刘瑞，罗克明西南大学生命科学学院，西南大学资源植物研究所，重庆 400715

应用CRISPR/Cas9技术在杨树中高效敲除多个靶基因

刘婷婷，范迪，冉玲玉，姜渊忠，刘瑞，罗克明
西南大学生命科学学院，西南大学资源植物研究所，重庆 400715

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术。本课题组在前期工作中利用该系统在毛白杨(Populus tomentosa Carr.)中率先实现了对内源基因—八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene dehydrogenase, PDS)基因的定点敲除。为研究靶点的设计和选择对该系统介导的杨树内源基因敲除效率的影响，本文分析了不同单向导RNA(Single-guide RNA, sgRNA)结合毛白杨PDS(PtPDS)靶基因DNA序列后对突变效率的影响。结果发现sgRNA与靶基因间的碱基错配会导致突变的效率降低，甚至不能突变，其中3′端的碱基配对更为重要。进一步测序分析发现，该系统能同时敲除杨树基因组上两个同源的 PDS编码基因(PtPDS1和PtPDS2)，突变率分别达86.4%和50%。研究证明该系统可快速高效地敲除两个以上的内源基因，获得多重突变体杨树株系。利用该技术，本课题组已获得多个杨树转录因子及结构基因的敲除突变体株系，为将来开展基因功能研究和杨树遗传改良奠定了基础。

CRISPR/Cas9；杨树；定点敲除；多基因；八氢番茄红素脱氢酶

随着锌指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)技术、转录激活样效应因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)技术和成簇规律间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)技术为代表的基因组编辑新技术的出现，使得基因组定位修饰、定向突变和定点整合成为可能[1,2]。其中，CRISPR/Cas9技术是基于细菌体内的获得性免疫机制改造而成，可通过一条单链的单向导 RNA(Single-guide RNA, sgRNA)来识别特定的DNA序列，并引导Cas9核酸内切酶剪切DNA双链[3]。相比ZFN 和TALEN技术，CRISPR/Cas9系统具有明显的优势：只需设计一段与靶位点配对的含几十个碱基的核苷酸序列，操作简单，实验周期短，花费不高。因此，该技术已被广泛应用于细菌、酵母和动物的基因组编辑中[4]。

2013年，中国、美国和英国的3个研究团队同时报道了利用CRISPR/Cas9系统在植物中实现了对内源基因的定点突变：中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队利用CRISPR/Cas9系统定点突变了水稻和小麦两个作物的OsPDS和TaMLO等5个基因，并通过同源重组DNA修复途径，利用单链寡核苷酸DNA(Single-strain DNA , ssDNA)作为模板在基因组特定位点精确插入了12 bp序列[5]；哈佛大学和塞恩斯伯里实验室团队利用该技术分别在拟南芥和烟草中敲除了内源AtPDS和NbPDS等基因[6,7]。这些研究首次证实了CRISPR/Cas9系统能够用于植物的基因组编辑。到目前为止，人们利用该系统先后在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)以及水稻(Oryza sativa)[8,9]、小麦(Triticum aestivum)[5,10]、玉米(Zea mays)[11]、高粱(Sorghum bicolor)[12]、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、番茄(Lycopersicon esculentum)[13]等作物中成功实现了基因组编辑，这也是目前唯一在植物中实现了广泛应用的基因组定点编辑技术[14]。然而，多数研究都是在草本植物中展开，该技术在木本植物中的应用报道目前还比较少。

作为全球种植面积最大的速生经济林树种，杨树(Populus)具有重要的商业价值和生态价值。2006年，杨树作为首个完成基因组测序的多年生木本植物[15]，其基因组信息的公布为在该物种中开展功能基因组学的研究奠定了基础。因此，近年来杨树已经发展为全世界公认的木本模式植物。然而，由于木本植物自身固有的特点，对杨树基因功能的研究存在诸多技术困难。尤其是其非常长的繁殖周期和较低的遗传转化效率，限制了遗传研究手段在杨树中的应用，导致人们迄今仅获得了极少数的杨树基因突变体[16,17]。因此，如果能通过新的技术手段实现高效的杨树基因突变，将十分有利于林木的遗传改良研究。

在前期工作中，本实验室利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统[18]，在杨树体内同时表达 Cas9蛋白和多个针对八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene dehydrogenase, PDS)基因的sgRNA，在杨树体内实现了对内源基因的高效定点敲除，成功运用CRISPR/Cas9技术在木本植物中获得了稳定的基因定点敲除的突变体株系[19]。利用CRISPR/Cas9系统在T0代转基因杨树中可实现50%以上突变效率，具有快速、高效的特点，因而在杨树的功能基因研究和遗传改良中具有广泛的应用前景。2015年，Zhou 等[20]利用 Cas9技术在杨树中定点敲除了杨树内源的4CL基因。

为了进一步研究CRISPR/Cas9系统在杨树中的敲除特性，本研究设计和构建了含有不同sgRNA个数的一系列敲除载体，并遗传转化杨树，通过测序分析了PtPDS基因不同靶点上发生核酸序列改变的形式和效率，证明sgRNA内3′端的序列对于识别和介导靶基因突变更为重要，为杨树内源靶点的设计和选择提供了参考依据。进一步利用生物信息分析和基因克隆，发现杨树基因组内存在两个同源的PDS编码基因，而多靶点系统能够同时识别和敲除这两个杨树内源PDS基因，导致突变体出现白化的表型，表明多靶点CRISPR/Cas9系统具备同时快速高效地敲除多个内源基因的优势。最后，本文利用该系统成功敲除了多个杨树内源基因，构建了杨树突变体库，为开展基因功能研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

毛白杨(Populus tomentosa Carr. clone 741)在温室中培养，温度25℃，14 h/10 h 光照/黑暗，光照强度4500 lx。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101(本实验室保存)。pYLCRISPR/Cas9-DH植物表达载体系统由华南农业大学刘耀光教授提供。

1.2 方法

1.2.1 杨树组培和遗传转化

遗传转化方法为叶盘法[21]。取杨树无菌苗幼嫩叶片，切成0.5 cm小块，菌液浸染8～10 min；取出叶片，背面向下平铺在WPM1[WPM培养基(NH4N03400 mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 556 mg/L、K2SO4990 mg/L、CaCl2·2H2O 96 mg/L、KH2PO4170 mg/L、Na2MoO4· 2H2O 0.25 mg/L、MgSO4·7H2O 370 mg/L、MnSO4·H2O 22.4 mg/L、ZnSO4·H2O 8.6 mg/L、CuSO4·5H2O 0.25 mg/L、FeSO4·7H2O 27.8 mg/L、Na2-EDTA 37.3 mg/L、肌醇 100 mg/L、维生素B1 1.0 mg/L、烟酸 0.5 mg/L、维生素B6 0.5 mg/L、甘氨酸2.0 mg/L、蔗糖20 g/L、琼脂 6 g/L，pH 5.2)加萘乙酸1.0 mg/L、乙酰丁香酮100 μmol/L]共培养基上，暗培养 2 d；移到WPM2(WPM培养基加玉米素 2 mg/L、萘乙酸1.0 mg/L、头孢霉素400 mg/L、潮霉素90 mg/L)选择培养基上，光照培养3～4周；长出愈伤后移入生芽培养基WPM3(WPM培养基加玉米素2 mg/L、萘乙酸0.1 mg/L、头孢霉素400 mg/L、潮霉素90 mg/L)，光照培养4～5周；不定芽切下并转入WPM4(WPM培养基加萘乙酸0.1 mg/L、头孢霉素400 mg/L、潮霉素90 mg/L)中生根。

1.2.2 Cas9靶点设计

基于 PtPDS1基因组序列，本文利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2 (http://zifit.partners.org/Zi-FiT/Introduction.aspx)查找潜在的Cas9靶点[22]。根据靶点的位置和GC含量选择其中4个(T1/T2/T3/T4)设计sgRNA(图2A)。靶点的序列分别为T1：5’-TGAGTGCATTGAACTTGAGC-3’；T2：5’-GTGTTATCAAGGTCCGGTCT-3’；T3：5’-TTCACCGTGTTATCAAGGTC-3’；T4：5’-CCATTAAATGTTGTCATTGC-3’。

1.2.3 Cas9植物表达载体构建

载体系统包含了双元的植物表达载体pYLCRISPR/Cas9-DH和针对T1到T4的4个sgRNA表达盒中间载体，前者以35S超表达Cas9，后者分别以AtU3b、AtU3d、AtU6-1和AtU6-29四个启动子分别驱动 sgRNA的表达[22]。载体构建采用 Golden Gate Cloning方法[23]。

1.2.4 基因组DNA提取

取恒定转化的T0代植株材料约0.1 g，采用CTAB法提取杨树基因组DNA。

1.2.5 突变检测

以转基因植株的基因组DNA为模板，PCR扩增杨树内源PDS基因5′端部分序列。PCR引物如下：

PtPDS-F: 5’-GTTGAATTTGGTTTTGGAGAAATG-3’；

PtPDS-R1: 5’-CCAAGTATTTTGCAGTCGATAAACCCG-3’；

PtPDS-R2: 5’-CCAAATATTTTGCAGTAGATAAACCAG-3’。

用PtPDS-F和PtPDS-R1引物组合扩增PtPDS1；用PtPDS-F和PtPDS-R2引物组合扩增PtPDS2。PCR扩增产物经胶回收后连接到pMD19-T Simple (宝生物工程(大连)有限公司)载体上，挑单克隆测序。利用DNAMAN(Version 7.0)对所有测序获得的序列和PtPDS基因的参考序列进行比对分析，并进行统计。

2 结果与分析

2.1 多靶点CRISPR/Cas9系统敲除效率的分析

本实验室前期研究已经证明，针对杨树 1个PtPDS基因序列上的不同靶点，用4个对应的sgRNA可高效地介导Cas9对杨树内源基因的敲除，在转基因T0代杨树即出现白化的表型[19]。然而，是不是一定需要多个sgRNA才能达到如此高的敲除效率？这些sgRNA在导致杨树白化表型中的作用是否存在差异？这些问题尚不清楚。因此，本文设计了一组载体，分别带有4个(PtPDS×4)、3个(PtPDS×3)、2个(PtPDS×2)和1个(PtPDS×1)针对PtPDS的sgRNA。受该系统载体构建方法的限制，这一组载体上携带哪些sgRNA是按照不同sgRNA表达盒连入载体的顺序，而不是按照sgRNA在基因上结合位点的顺序来设计的。其中，PtPDS×4含有针对杨树内源PDS座位上全部4个靶序列的sgRNA；而PtPDS×3含有结合T1、T2、T4的sgRNA；PtPDS×2含结合T1、T4的 sgRNA；PtPDS×1只有一个结合 T1位点的sgRNA(图1)。将上述载体和作为对照的空载体分别转化杨树，发现T0代的再生植株在表型上有明显差异：PtPDS×4(图1A)和PtPDS×3(图1B)转化的T0代植株中，有部分叶片和幼茎出现白化表型，推测是因内源PDS缺陷导致叶绿素合成受阻所引起的。而PtPDS×2(图1C)和PtPDS×1(图1D)转化的植株中则未发现该白化的表型，与转化空载体的对照组(表1)一样，均为正常的绿色。

图1 多靶点CRISPR/Cas9系统转化毛白杨后的T0代表型分析

表1 T0代Cas9转化杨树的表型分析

经统计分析，发现PtPDS×4和PtPDS×3的T0代转化植株中分别有 51.7%(30/59)和 53.8%(21/39)出现白化表型，两者间并无显著差异；而 PtPDS×2 和PtPDS×1的相应比例为0%(分别统计了T0代植株38棵和123棵)，与前两者存在明显的差异(表1)。这一结果暗示，结合T3的sgRNA对于导致植物白化可能无作用，而结合T2的sgRNA对植物产生白化表型是必需的。

经统计分析，发现PtPDS×4和PtPDS×3的T0代转化植株中分别有 51.7%(30/59)和 53.8%(21/39)出现白化表型，两者间并无显著差异；而 PtPDS×2 和PtPDS×1的相应比例为0%(分别统计了T0代植株38棵和123棵)，与前两者存在明显的差异(表1)。这一结果暗示，结合T3的sgRNA对于导致植物白化可能无作用，而结合T2的sgRNA对植物产生白化表型是必需的。

2.2 不同sgRNA对杨树PDS同源基因结合能力的差异分析

从图1可见，当只有针对T1和T4的sgRNA时(PtPDS×2)，不足以导致 PDS基因功能的完全缺陷从而引起植物白化。而本实验室之前已经通过测序证明，内源PDS基因的T1靶点能够在Cas9的作用下产生突变[19]。上述结果提示在杨树基因组内，除了本文所检测的一个PDS基因外，可能存在其他多个编码PDS的基因拷贝。利用同源序列比对，本文在毛果杨(测序种)基因组(http://phytozome.jgi.doe.gov)中找到了两个与拟南芥PDS3(AT4G14210)高度同源的基因：Potri.002G235200和Potri.014G148700。通过设计引物，从杨树基因组中克隆到两个PDS的编码基因(5′端部分序列)，分别命名为 PtPDS1和PtPDS2，两者序列相似性达到 89.1%，但在很多位点上仍存在核苷酸的多态性，因此可以设计特异的引物分别扩增和检测这两个基因(图2A)。

对两个杨树内源基因的5′端序列分析发现，PtPDS1的序列与4个sgRNA均能完全配对；而PtPDS2的序列则与所有sgRNA均存在1～2 bp的碱基错配。其中，T1靶序列中1 bp错配的碱基位于靠近NGG的识别序列3′端位置。T2、T3和T4内发生错配的碱基均位于离3′端12 bp以上的位置(图2B)。之前的研究发现，靠近3′端的错配对于sgRNA识别和结合靶点的影响可能较大，反之则可能影响较小[24,25]。因此推测，结合T1位点的sgRNA仅能结合到PtPDS1上，而不能结合PtPDS2，故不能介导对后者的有效敲除。

2.3 CRISPR/Cas9可同时敲除多个内源基因

为了证明序列的错配可能引起 sgRNA对两个内源PDS基因(PtPDS1和PtPDS2)结合效率的差异，本文对PtRDS×3转基因的T0代植株中内源PDS基因的序列进行测序分析。在随机挑选测序的 44个PtPDS1基因克隆中，有21个在T1靶点的位置发生了突变，突变率为 47.7%(图 3A)。在测序的 24个PtPDS2基因克隆中，未检测到任何突变(图3B)。该结果证明sgRNA能够介导Cas9对PtPDS1的剪切，而对 PtPDS2无作用。暗示可能是由于序列与PtPDS2存在碱基错配，因而sgRNA不能稳定地结合并引导Cas9结合到PtPDS2的T1位置上来。在T2位点，PtPDS1和PtPDS2均能检测到序列突变，发生突变的概率分别为 86.4%(38/44)和 50%(23/46)(图3)。说明T2的sgRNA可以识别两个基因，但可能由于近5’端序列与PtPDS2的1 bp错配，影响了结合的效率进而影响了突变率。在T4位点，两个基因均未检测到突变(图3)。

由此可见，序列上的差异确实可以导致sgRNA对基因结合能力的差异。其中靠近靶点3′端NGG的碱基错配对结合能力的影响也比较大，可能导致完全不能结合，而远离3′端的错配也会对结合的效率产生影响。这与之前在动物和人体细胞中的研究结果相符[24]，为设计杨树的 Cas9靶点提供了参考依据。另一方面，测序结果证明针对T1靶点的sgRNA只结合 PtPDS1，不结合 PtPDS2；针对 T4靶点的sgRNA对PtPDS1和 PtPDS2均不能结合。提示在PtPDS×2(含针对T1和T4的sgRNA)转基因植株中只有PtPDS1是缺陷的，而PtPDS2则维持正常功能，这就解释了植株未出现白化表型的原因(图 1C)。在PtPDS×3的 T0转基因植株中，多靶点的 CRISPR/ Cas9能高效地将两个内源基因同时敲除掉(图3)。证明该系统具备在杨树内实现快速、高效的对多个基因定点编辑的能力。

图3 PtPDS×3转基因杨树内源PDS基因突变分析

2.4 利用 CRISPR/Cas9技术构建杨树功能基因突变体库

通过对PtPDS基因的高效敲除，本文初步建立了杨树CRISPR/Cas9基因定点敲除技术。而仅仅敲除PDS不足以证明该系统在杨树中具有广泛的应用性。因此，利用该技术，本文选择多个在杨树生长发育、新陈代谢和环境响应中具有重要作用的基因和基因家族，构建它们的突变体株系。PtPIN1和PtPIN7是杨树中生长素跨膜转运因子的编码基因，与拟南芥AtPIN1的同源性最高，对生长素的极性分布具有重要作用[26,27]。本文从PtPIN1和PtPIN7的基因序列上选择3个靶点，通过多靶点的Cas9系统再次实现同时敲除两个内源基因，敲除效率接达30%以上(表2)。结果再次证明该系统具备同时快速高效地敲除多个内源基因的优势。PtWRKY18和PtMYB170分别属于杨树WRKY 和MYB转录因子家族，分别在植物对病害的免疫防御机制和次生代谢产物合成的调控机制中扮演这重要角色[28, 29]。为了进一步研究它们的功能，本文通过 CRISPR/Cas9系统成功获得了两者各自的突变体株系(表2)，表明该CRISPR/Cas9系统可广泛适用于杨树内源基因的定点编辑。

此外，本课题组还构建和转化了用于敲除在植物发育中具有重要作用的 SHOOT MERISTEMLESS (STM)[30]、WUSCHEL(WUS)[31]等10多个转录因子和蛋白酶基因的CRISPR/Cas9载体(表2)，初步开始构建了杨树重要功能基因的突变体库。为木本植物发育、代谢的分子机制研究和林木基因资源的开发利用奠定了基础。

表2 利用Cas9系统构建的杨树功能基因和转录因子突变体

3 讨 论

长期以来，因为缺乏突变体，对杨树等木本植物基因功能的研究主要采用超量表达和 RNAi的手段。但是，由于同源或异源的基因超表达，无法准确模拟内源基因的表达水平和时空表达特异性，其结果的可靠性常受到质疑。RNAi的方法同样有特异性差、效率不高、范围受限等缺陷。如果能够获得突变体株系，与超表达材料对照分析，将会促进林学研究和遗传改良应用。因此，在初步建立起杨树的CRISPR/Cas9基因定点敲除后，选择敲除杨树中具有重要功能的基因，建立杨树功能基因的突变体库，对于深入研究木本植物中基因的生物学功能和其调控机理都具有重要的意义。

本研究发现，在同一转基因杨树的同一内源基因上，不同靶点的突变率也存在显著差异：PtPDS×3转基因T0代中，PtPDS1基因的T1、T2和T4靶点的突变率分别为47%、86%和0%(图3)。由于Cas9结合到DNA序列的特定位置依赖于sgRNA的引导，所以sgRNA对靶序列的结合能力会影响突变的效率[2,32]。其中，靶序列的 GC含量、碱基的分布、以及错配碱基的位置等均对sgRNA与DNA靶序列之间的亲和性有影响，需要在选择靶点时纳入考虑[33]。此外，sgRNA的表达水平的差异也是一个可能的原因。在多靶点系统中，不同的sgRNA是由多个不同的启动子来驱动的。T2位点上较高的突变率，暗示驱动其对应sgRNA的AtU6-29启动子在杨树体内可能具有较高的活性。

测序结果表明，CRISPR/Cas9系统在杨树体内引起的突变，主要是1～5 bp的小片段确缺失或者插入，偶尔也有发生较大片段的序列改变。例如，大于20 bp的片段插入或者删除；T1和T2之间295 bp的片段发生倒位(图 3)。这主要是由植物体内 DNA的修复机制所决定的，与Cas9无关[34]。这也提示，可以借助多靶点系统获得特定形式的突变体，如缺失某一特定结构域的基因突变体。此外，多靶点CRISPR/Cas9系统相比单靶点系统的一个主要优势在于大幅提高了突变的效率。在PtPDS×3转基因T0代中，PtPDS1单基因的突变概率达到近90%，远远高于在其他植物物种中所报道的突变率[14]。而该系统同时敲除PtPDS1和PtPDS2两个同源基因，导致PDS功能完全缺陷，产生白化表型的概率也高达50%左右。

在植物基因功能的研究中，常常需要获得两个或以上基因同时突变的材料，因为可能有多个同源基因功能冗余，或者多个不同源基因参与了平行的信号转导。对于拟南芥等模式植物，比较易于通过杂交、遗传转化等方法获得多突，然而，受制于漫长的繁殖周期和困难的二次遗传转化，以杨树为代表的木本植物很难获得多基因缺陷材料。利用多靶点的CRISPR/Cas9，可在转基因T0代就高效地获得多基因同时敲除的突变体株系。在本研究中，T2-sgRNA 起着关键的作用并足以引起两个内源PDS基因序列的突变。这主要是因为两个PDS基因在T2位点上序列基本一致。对于后期的应用，并非所有希望同时敲除的两个或多个基因，都有具有序列高度一致的Cas9靶点，这种情况下，多靶点系统就为人们提供了更多选择和更大的自由度。这种高效省时的基因突变方法对于杨树的遗传研究具有重要意义。

参考文献

[1] Bogdanove AJ, Voytas DF. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science, 2011, 333(6051): 1843-1846.

[2] Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science, 2014, 346(6213): 1258096.

[3] Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K, Chao YJ, Pirzada ZA, Eckert MR, Vogel J, Charpentier E. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature, 2011, 471(7340): 602-607.

[4] Wei CX, Liu JY, Yu ZS, Zhang B, Gao GJ, Jiao RJ. TALEN or Cas9-rapid, efficient and specific choices for genome modifications. J Genet Genomics, 2013, 40(6): 281-289.

[5] Shan QW, Wang YP, Li J, Zhang Y, Chen KL, Liang Z, Zhang K, Liu JX, Xi JJ, Qiu JL, Gao CX. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 686-688.

[6] Li JF, Norville JE, Aach J, McCormack M, Zhang DD, Bush J, Church GM, Sheen J. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 688-691.

[7] Nekrasov V, Staskawicz B, Weigel D, Jones JDG, Kamoun S. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 691-693.

[8] Mao YF, Zhang H, Xu NF, Zhang BT, Gou F, Zhu JK. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Mol Plant, 2013, 6(6): 2008-2011.

[9] Feng ZY, Zhang BT, Ding WN, Liu XD, Yang DL, Wei PL, Cao FQ, Zhu SH, Zhang F, Mao YF, Zhu JK. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Res, 2013, 23(10): 1229-1232.

[10] Wang YP, Cheng X, Shan QW, Zhang Y, Liu JX, Gao CX, Qiu JL. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat Biotechnol, 2014, 32(9): 947-951.

[11] Liang Z, Zhang K, Chen KL, Gao CX. Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system. J Genet Genomics, 2014, 41(2): 63-68.

[12] Jiang WZ, Zhou HB, Bi HH, Fromm M, Yang B, Weeks DP. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Res, 2013, 41(20): e188.

[13] Brooks C, Nekrasov V, Lippman ZB, Van Eck J. Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated9 system. Plant Physiol, 2014, 166(3): 1292-1297.

[14] Baltes NJ, Voytas DF. Enabling plant synthetic biology through genome engineering. Trends Biotechnol, 2015, 33(2): 120-131.

[15] Tuskan GA, DiFazio S, Jansson S, Bohlmann J, Grigoriev I, Hellsten U, Putnam N, Ralph S, Rombauts S, Salamov A, Schein J, Sterck L, Aerts A, Bhalerao RR, Bhalerao RP, Blaudez D, Boerjan W, Brun A, Brunner A, Busov V, Campbell M, Carlson J, Chalot M, Chapman J, Chen GL, Cooper D, Coutinho PM, Couturier J, Covert S, Cronk Q, Cunningham R, Davis J, Degroeve S, Déjardin A, Depamphilis C, Detter J, Dirks B, Dubchak I, Duplessis S, Ehlting J, Ellis B, Gendler K, Goodstein D, Gribskov M, Grimwood J, Groover A, Gunter L, Hamberger B, Heinze B, Helariutta Y, Henrissat B, Holligan D, Holt R, Huang W, Islam-Faridi N, Jones S, Jones-Rhoades M, Jorgensen R, Joshi C, Kangasjärvi J, Karlsson J, Kelleher C, Kirkpatrick R, Kirst M, Kohler A, Kalluri U, Larimer F, Leebens-Mack J, Leplé JC, Locascio P, Lou Y, Lucas S, Martin F, Montanini B, Napoli C, Nelson DR, Nelson C, Nieminen K, Nilsson O, Pereda V, Peter G, Philippe R, Pilate G, Poliakov A, Razumovskaya J, Richardson P, Rinaldi C, Ritland K, Rouzé P, Ryaboy D, Schmutz J, Schrader J, Segerman B, Shin H, Siddiqui A, Sterky F, Terry A, Tsai CJ, Uberbacher E, Unneberg P, Vahala J, Wall K, Wessler S, Yang G, Yin T, Douglas C, Marra M, Sandberg G, Van de Peer Y, Rokhsar D. The genome of black cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray). Science, 2006, 313(5793): 1596-1604.

[16] Fladung M, Polak O. Ac/Ds-transposon activation tagging in poplar: a powerful tool for gene discovery. BMC Genomics, 2012, 13: 61.

[17] Polle A, Janz D, Teichmann T, Lipka V. Poplar genetic engineering: promoting desirable wood characteristics and pest resistance. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(13): 5669-5679.

[18] Ma XL, Zhang QY, Zhu QL, Liu W, Chen Y, Qiu R, Wang B, Yang ZF, Li HY, Lin YR, Xie YY, Shen RX, Chen SF, Wang Z, Chen YL, Guo JX, Chen LT, Zhao XC, Dong ZC, Liu YG. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants. Mol Plant, 2015, 8(8): 1274-1284.

[19] Fan D, Liu TT, Li CF, Jiao B, Li S, Hou YS, Luo KM. Efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Populus in the first generation. Sci Rep, 2015, 5: 12217.

[20] Zhou XH, Jacobs TB, Xue LJ, Harding SA, Tsai CJ. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate: CoA ligase specificity and redundancy. New Phytol, 2015, doi: 10.1111/nph.13470.

[21] Jia ZC, Sun YM, Yuan L, Tian QY, Luo KM. The chitinase gene (Bbchit1) from Beauveria bassiana enhances resistance to Cytospora chrysosperma in Populus tomentosa Carr. Biotechnol Lett, 2010, 32(9): 1325-1332.

[22] Sander JD, Maeder ML, Reyon D, Voytas DF, Joung JK, Dobbs D. ZiFiT (Zinc Finger Targeter): an updated zinc finger engineering tool. Nucleic Acids Res, 2010, 38(Suppl 2): W462-W468.

[23] Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, Marillonnet S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One, 2009, 4(5): e5553.

[24] Kuscu C, Arslan S, Singh R, Thorpe J, Adli M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol, 2014, 32(7): 677-683.

[25] Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol, 2014, 32(4): 347-355.

[26] Carraro N, Tisdale-Orr TE, Clouse RM, Knoller AS, Spicer R. Diversification and expression of the PIN, AUX/LAX, and ABCB families of putative auxin transporters in Populus. Front Plant Sci, 2012, 3: 17.

[27] Liu BB, Zhang J, Wang L, Li JB, Zheng HQ, Chen J, Lu MZ. A survey of Populus PIN-FORMED family genes reveals their diversified expression patterns. J Exp Bot, 2014, 65(9): 2437-2448.

[28] Jiang YZ, Duan YJ, Yin J, Ye SL, Zhu JR, Zhang FQ, Lu WX, Fan D, Luo KM. Genome-wide identification and characterization of the Populus WRKY transcription factor family and analysis of their expression in response to biotic and abiotic stresses. J Exp Bot, 2014, 65(22): 6629-6644.

[29] Chai GH, Wang ZG, Tang XF, Yu L, Qi G, Wang D, Yan XF, Kong YZ, Zhou GK. R2R3-MYB gene pairs in Populus: evolution and contribution to secondary wall formation and flowering time. J Exp Bot, 2014, 65(15): 4255-4269.

[30] Groover AT, Mansfield SD, DiFazio SP, Dupper G, Fontana JR, Millar R, Wang Y. The Populus homeobox gene ARBORKNOX1 reveals overlapping mechanisms regulating the shoot apical meristem and the vascular cambium. Plant Mol Biol, 2006, 61(6): 917-932.

[31] Liu BB, Wang L, Zhang J, Li JB, Zheng HQ, Chen J, Lu MZ. WUSCHEL-related Homeobox genes in Populus tomentosa: diversified expression patterns and a functional similarity in adventitious root formation. BMC Genomics, 2014, 15: 296.

[32] Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, Topkar VV, Nguyen NT, Zheng ZL, Gonzales APW, Li ZY, Peterson RT, Yeh JJ, Aryee MJ, Joung JK. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature, 2015, 523(7561): 481-485.

[33] Xu H, Xiao TF, Chen CH, Li W, Meyer CA, Wu Q, Wu D, Cong L, Zhang F, Liu JS, Brown M, Liu SX. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Res, 2015, 25(8): 1147-1157.

[34] Ramalingam S, Annaluru N, Chandrasegaran S. A CRISPR way to engineer the human genome. Genome Biol, 2013, 14(2): 107.

(责任编委: 高彩霞)

Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of multiple genes in Populus

Tingting Liu, Di Fan, Lingyu Ran, Yuanzhong Jiang, Rui Liu, Keming Luo
Institute of Resources Botany, School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China

The typeⅡCRISPR/Cas9 system (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated 9) has been widely used in bacteria, yeast, animals and plants as a targeted genome editing technique. In previous work, we have successfully knocked out the endogenous phytoene dehydrogenase (PDS) gene in Populus tomentosa Carr. using this system. To study the effect of target design on the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Populus, we analyzed the efficiency of mutagenesis using different single-guide RNA (sgRNA) that target PDS DNA sequence. We found that mismatches between the sgRNA and the target DNA resulted in decreased efficiency of mutagenesis and even failed mutagenesis. Moreover, complementarity between the 3′ end nucleotide of sgRNA and target DNA is especially crucial for efficient mutagenesis. Further sequencing analysis showed that two PDS homologs in Populus, PtPDS1 and PtPDS2, could be knocked out simul-taneously using this system with 86.4% and 50% efficiency, respectively. These results indicated the possibility of introducing mutations in two or more endogenous genes efficiently and obtaining multi-mutant strains of Populus using this system. We have indeed generated several knockout mutants of transcription factors and structural genes in Populus, which establishes a foundation for future studies of gene function and genetic improvement of Populus.

CRISPR/Cas9; Populus; targeted mutagenesis; multiple genes; phytoene dehydrogenase (PDS)

2015-07-03;

2015-07-26

国家自然科学基金项目(编号：31300990, 31171620)和中央高校基本科研业务费(编号：XDJK2014C062)资助

刘婷婷，硕士研究生，专业方向：植物遗传与发育。E-mail: 1023417738@qq.com范迪，讲师，研究方向：植物表观遗传。E-mail: fandi_biology@163.com刘婷婷和范迪同为第一作者。

罗克明，博士，教授，研究方向：植物分子生物学和基因工程。E-mail: kemingl@swu.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-303

时间:2015/9/22 16:23:03

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150922.1623.003.html