巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)产聚乳酸降解酶条件的研究

崔 婧 ，翟丽华,时东方，陈 珊

(1.长春师范大学中心实验室，吉林长春 130032；2.长春市第48中学，吉林长春130051；3.东北师范大学生命科学学院，吉林长春 130024)

巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)产聚乳酸降解酶条件的研究

崔 婧1,3，翟丽华2,时东方1，陈 珊3

(1.长春师范大学中心实验室，吉林长春 130032；2.长春市第48中学，吉林长春130051；3.东北师范大学生命科学学院，吉林长春 130024)

巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)具有降解聚乳酸的能力。对该菌的产PLA降解酶的发酵条件进行优化，发酵产聚乳酸降解酶的最佳条件为：产酶诱导物为酵母粉，培养时间为36h，培养基初始pH为8.0，发酵温度为40℃，摇床转速为175r·min-1，接种量为5%(V/V)。

巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)； PLA降解酶；产酶条件优化

聚乳酸(PLA)是以乳酸为原料聚合而成，可用植物中的淀粉来进行生产，而不消耗石油资源。PLA制品在土壤中最终被降解为CO2和H2O，降低环境污染，减少温室效应。PLA除了具有可生物降解性和植物来源性这两大特点外，还具有较好的机械性能、生物相容性和易于加工的特性，因此近年来得到了研究者的广泛关注，被认为是可以代替常规塑料的新型“生态材料”之一[1-4]。

虽然PLA与PHB、PCL及PBS等其它聚酯类材料相比在性能上具有明显的优势，但PLA的自然降解速率较为缓慢，目前发现能够降解PLA的微生物和降解酶也比较少[5-6]，不到0.04%[7-9]。因此，只有深入了解PLA生物降解的机理，加快PLA的生物降解，才能够真正实现PLA的利用。

1 材料与方法

1.1 培养基

基本培养基：(NH4)2SO41g·L-1，酵母提取物 0.25 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，CaCl2·2H2O 0.02 g·L-1，FeSO4·7H2O 0.01g·L-1，MnSO40.5mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5mg·L-1，Na2WO40.5mg·L-1，pH为8.0。

1.2 PLA降解酶活力的测定方法

按照乳酸试剂盒(南京建成)，将50μL样品与500μL酶工作液混匀，再加入100μL显示剂，在37℃下共同作用1h，最后加入1000μL终止液，在530nm下测定吸光度值。通过上清液中乳酸的生成量来表征PLA降解酶活力。

1.3 诱导物对菌株产酶的影响

在基本培养基中分别加入明胶、酵母、酪蛋白、酪氨酸、蛋白胨、PLA 等不同诱导物，浓度为0.3%。发酵培养24h后取样，测定在不同诱导物作用下聚乳酸降解酶活力，比较不同诱导物的诱导作用。

1.4 发酵条件的优化

在确定发酵最佳诱导物后，对该菌的产PLA降解酶活力最高的发酵时间、初始pH值、发酵温度、摇床转速、接种量等条件进行优化，获得最适的产酶条件。

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1.4.1 发酵时间对菌株产酶的影响

以酵母粉为诱导物，液体振荡培养，每隔12h取样，分别测定酶活力。

1.4.2 发酵初始pH值对菌株产酶的影响

在发酵初始pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的酵母液体培养基中，振荡培养36h，然后取样测酶活力。

1.4.3 发酵温度对菌株产酶的影响

将发酵温度设定为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，摇床培养36h，测定酶活力。

1.4.4 摇床转数对菌株产酶的影响

1.4.5 接种量对菌株产酶的影响

在100ml培养基中，分别接种2ml、4ml、5ml、6ml、8ml、10ml，在40℃下振荡培养36h，取样测定酶活力。

2 结果与分析

2.1 诱导物对菌株产酶的影响

据文献报道， PLA降解酶可能属于蛋白酶类，因此用蛋白类物质对Bacillusmegaterium产PLA降解酶的过程进行诱导，结果如图1所示。Bacillusmegaterium分泌的PLA 降解酶确实受蛋白类物质的诱导，其中酵母粉显著提高酶活力，因此将酵母粉定为发酵产PLA降解酶的最佳诱导物。

图1 诱导物对菌株产酶的影响

2.2 发酵时间对菌株产酶的影响

在基本培养基中加入酵母粉作为诱导物，在发酵的第12h、36h、48h、60h、72h取样，测定酶活力，如图2所示，随着发酵时间的增长，酶活力逐渐升高，这是因为随着时间延长，菌体数量增多，产酶增加，在第36h酶活力最高。在36h后，随着时间延长，酶活力逐渐降低，菌体生长进入衰退期，因此把发酵时间定为36h。

图2 发酵时间对菌株产酶的影响

2.3 发酵初始pH对菌株产酶的影响

在初始pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的条件下培养，发酵36h后取样，测定酶活力。结果如图3所示，发酵初始pH值对菌株产PLA降解酶影响比较明显。当起始pH值小于8.0时，酶活力逐渐降低；pH值为8.0时，酶活力较高；pH值为9.0时，酶活力最高，这可能是因为在碱性条件下聚乳酸自身发生降解。因此选pH为8.0为最适产酶初始pH值。

图3 发酵初始pH对菌株产酶的影响

2.4 发酵温度对菌株产酶的影响

在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下进行发酵培养，培养36h后取样，测定在不同温度下发酵产PLA降解酶活力。结果如图4所示，温度在40℃时，酶活力最高；在40～45℃之间，随着温度升高酶活力下降；但在50℃时，酶活力再次升高，这可能是因为高温偏碱条件下聚乳酸自身发生降解。所以培养温度不宜过高，选择最适发酵温度为40℃。

图4 培养温度对菌株产生聚乳酸解聚酶酶活力的影响

2.5 摇床转数对菌株产酶的影响

在100r·min-1、125 r·min-1、150 r·min-1、 175 r·min-1、200 r·min-1条件下分别培养，36h后取样测酶活力。结果如图5所示，当摇床转速低于175 r·min-1时，酶活力随转速下降而逐渐降低，因为通氧量比较低；当摇床转速大于175 r·min-1时，随摇床转速的提高，酶活力也逐渐下降。因此发酵的最佳摇床转数为175 r·min-1。

图5 摇床转数对菌株产酶的影响

2.6 接种量对菌株产酶的影响

接种量分别为2%、4%、5%、6%、8%、10%，发酵36h取样，测定酶活力。由图6可知，随着接种量升高，酶活力逐渐升高，当接种量达到5%时，酶活力最高；继续提高接种量酶活反而降低，因此发酵时最佳接种量为5%。

图6 接种量对菌株产生聚乳酸解聚酶酶活力的影响

3 结论

Bacillusmegaterium具有降解聚乳酸的能力。据文献报道，很多聚乳酸降解酶属于蛋白酶类。本文以明胶、蛋白胨、酪氨酸、酪蛋白、酵母粉等蛋白类物质作为诱导物，发现Bacillusmegaterium产PLA降解酶活力都有提高，这其中以加入酵母粉后产PLA降解酶活力最高，由此推断该产的PLA降解酶可能属于蛋白酶类，最适诱导物为酵母粉。

用液体振荡培养法，优化Bacillusmegaterium菌产PLA降解酶的发酵条件，结果显示：菌株产酶的最适发酵时间为36h，培养基起始pH为8.0，产酶最适温度为40℃，最适摇床转速为175 r·min-1，接种量为5%(V/V)。这为进一步研究PLA降解酶的分离纯化奠定了基础。

[1]张敏,崔春娜,宋杰,等.聚乳酸降解的影响因素和降解机理的分析[J].包装工程,2008,29(8):16-18.

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[3]鲁玺丽,蔡伟,赵连城.高分子量聚L-乳酸的合成和表征[J].功能材料,2004,35(z1):2287-2289.

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[5]李凡,王莎,刘巍峰,等.聚乳酸(PLA)生物降解的研究进展[J].微生物学报,2008,48(2):262-268.

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[7]Ikura Y,Kudo T.Isolation of a microorganism capable of degrading poly (L-lactide)[J].J Gen Appl Microbiol,1999,45(5):247-251.

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2015-07-25

崔 婧(1986- )，女，吉林长春人，长春师范大学中心实验室助理实验师，硕士，从事生物化学与分子生物学研究。

陈 珊(1956- )，女，吉林长春人，教授，博士，硕士生导师，从事环境微生物研究。

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2095-7602(2015)12-0050-04