基于大孔树脂分离宣木瓜醇提物的不同极性部位主要活性成分分析

吴 茜，查日维，谢晓梅，吴蓓丽，况作品，杨 沫

(安徽中医药大学药学院现代中药安徽省重点实验室，合肥230031)

中药木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai干燥近成熟果实;有平肝舒筋、和胃化湿之功效［1］，以安徽宣城产宣木瓜质量为佳［2-3］，三萜类、多酚以及多糖等［4-7］是木瓜活性成分的研究热点。已有文献［8］报道大孔树脂分离木瓜三萜类成分，但鲜见木瓜在大孔树脂不同洗脱部位活性成分分布研究的报道。本文在前期提取物研究［6，9］的基础上，用AB-8型大孔树脂分离宣木瓜75%乙醇提取物，收集不同浓度乙醇洗脱液，采用理化反应检识洗脱液中的成分群，用分光光度法、高效液相色谱法定量测定不同洗脱部位主要活性成分含量，旨在为宣木瓜有效部位制备和资源综合利用积累实验资料和科学依据。

1 实验材料

1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪(包括G1311A泵、G1322脱气机、G1313AZ自动进样器、G1313A柱温箱、G1315 DAD;ChemStation色谱工作站);BP211D电子天平(十万分之一，德国赛多利斯公司);KQ-250DB数控超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司);Milli-Q Advantage超纯水机(美国Millipore公司);765MC UV-vis(上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂)。

1.2 试剂 没食子酸，齐墩果酸、熊果酸、绿原酸、原儿 茶 酸(批 号 110831-200302，110709-200505，110712-200508，110753-200413，110809-200604)对照品由中国药品生物制品检定所提供;AB-8型大孔树脂(河北沧州宝恩化工有限公司，净品型);甲醇、乙腈为色谱纯，乙醇为食品级，其余试剂均为分析纯，实验所用水为超纯水。

1.3 药材 宣木瓜于2013年7月中旬采自安徽省宣城市新田镇宣木瓜种植基地，经安徽中医药大学彭华胜教授鉴定为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai的果实;采后即置沸水中烫至表皮灰白色，对半纵剖，晒干，备用。

2 方法与结果

2.1 醇提物的制备 称取宣木瓜样品粉末10 kg，加75%乙醇120 L，70℃回流提取2 h，过滤，滤渣再用相同溶剂等量提取1次，合并滤液，减压浓缩至膏状，60℃微波干燥50 min，得到2.8 kg醇提物。

2.2 AB-8大孔吸附树脂各极性部位制备

2.2.1 大孔树脂预处理及装柱 取净品级别AB-8树脂置无水乙醇浸泡24 h至充分溶胀，湿法装柱，树脂床径高比为1∶3，用蒸馏水洗至无醇味，备用。

2.2.2 上样溶液的制备 称取2.1项下醇提物适量，置具塞锥形瓶中，加入75%乙醇适量，摇匀，放置过夜，超声(40 kHz，250 W)30 min，2 000 r/min，离心30 min，上清液置旋转蒸发仪回收乙醇浓缩至合适浓度，备用。

2.2.3 最佳上样浓度试验 取AB-8树脂40 mL，按2.2.1项下处理后装柱，取宣木瓜醇提物适量，按2.2.2项下方法处理，分别制得浓度为0.112，0.168，0.224，0.28 g/mL的上样溶液20 mL，调节流出阀控制流出液速度，以3 mL/min流速上样;分别用3 BV的水，30%乙醇，50%乙醇，95%乙醇依序洗脱，洗脱流速为3 mL/min;收集洗脱液，水浴蒸干，减压干燥至恒定重量。比较95%乙醇洗脱部位的得率，分别为1.15%，1.76%，0.79%，1.18%，故确定醇提物浓度为0.168 g/mL为最佳上样浓度。

2.2.4 动态吸附曲线 取宣木瓜醇提物26.88 g，按2.2.2项下方法处理得到上样液160 mL，缓缓加入40 mL AB-8树脂柱中，调节流出阀控制流出流速为3 mL/min，每10 mL收集1分，依据前期试验及流出液检识反应结果，采用HPLC法［9］测定流出液中已知活性成分含量，结果表明，原儿茶酸、绿原酸在大孔树脂柱上较早出现泄漏现象，原儿茶酸在第5管即出现泄漏。通过original软件绘制动态吸附曲线。由此可知1 mL树脂负载0.168 g醇提物为最佳量。

2.2.5 各极性部位的制备 取500 g宣木瓜醇提物，按2.2.2项下制备浓度为0.168 g/mL上样液，缓缓加入600 mL AB-8树脂中，分别用水，30%乙醇，50%乙醇，95%乙醇各3 BV依序洗脱，洗脱流速3 mL/min，收集洗脱液，置旋转蒸发仪回收乙醇，水浴蒸干，减压干燥至恒定重量，计算得率;平行制备3份，结果见表1。将制备所得各极性部位密封，置阴凉处保存，备用。

2.3 各极性部位的成分检识 分别称取2.2.5项下所得的不同极性部位各0.5 g置5 mL容量瓶中，加甲醇适量超声溶解，放冷，定容。在试管或点滴板上对不同部位进行理化检识［10］，根据各类成分特有化学反应产生的颜色、沉淀等，进行定性试验，以了解不同部位中可能含有的化学成分类型，其结果见表1。可知洗脱液均未检出生物碱、蛋白质、鞣质及黄酮类成分;水，30%乙醇洗脱液检出糖和苷类及香豆素类结构的成分;30%，50%乙醇洗脱液检出有酚类成分;50%，95%乙醇洗脱液检出甾体或三萜类成分，进一步泡沫试验显示为三萜类。空白试验结果均呈阴性，表明树脂和试剂对检识反应无干扰。

2.4 各极性部位主要成分的含量测定 由检识反应结果可知，AB-8大孔树脂能够较好的分离宣木瓜醇提物中多糖、多酚、三萜类成分。参照文献［9］，分别以硫酸-苯酚法、福林-酚法、HPLC法定量测定各部位中总多糖、总多酚、原儿茶酸及绿原酸、齐墩果酸及熊果酸的含量。

2.4.1 总多糖的测定

表1 洗脱液成分检识试验结果

2.4.1.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品10.60 g，置于50 mL量瓶中，加水溶解、稀释至刻度，得每1 mL含葡萄糖0.212 mg的对照溶液。

2.4.1.2 供试品溶液的制备 分别精密称取2.2.5项下所得的不同极性部位各0.3 g，置于锥形瓶中，精密加水30 mL，超声(250 W，40 kHz)30 min，冷却至室温，称重，加水补足减失的重量，抽滤，弃去初滤液，精密量取续滤液2～10 mL离心管中，加无水乙醇8 mL;离心(4 000 r/min)1 h，弃去上清液，沉淀加水溶解，定容至25 mL量瓶中，备用。

2.4.1.3 标准曲线的绘制 精密量取葡萄糖对照品溶液0.10，0.20，0.40，0.80，1.00 mL 至具塞试管中，加水补足至1.0 mL，加5%苯酚1.0 mL，混匀，加浓硫酸6.0 mL，立即摇匀，沸水浴10 min，冷却至室温，以相应试剂溶液为空白，在485 nm处测吸光度，以吸光度(Y)为纵坐标，葡萄糖溶液浓度(X)为横坐标，建立回归方程:Y=4.261X+0.114，r=0.999 4，表明葡萄糖浓度在9.92～99.20 μg/mL与吸光度线性关系良好。

2.4.1.4 样品总多糖含量测定 精密称取供试品，按2.4.1.2项下制备供试品溶液，精密量取2.0 mL，按2.4.1.3项下操作，自“加5%苯酚1.0 mL”起，在485 nm处测吸光度，利用标准曲线法计算各极性部位总多糖的含量。结果见表2。

2.4.2 总多酚的测定

2.4.2.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品1.72 mg，置5 mL棕色量瓶中，加水溶解、稀释至刻度，得每1 mL含没食子酸0.344 mg的对照溶液。

2.4.2.2 供试品溶液的制备 分别精密称取2.2.5项下所得的不同极性部位各0.15 g，置于锥形瓶中，精密加水30 mL，放置过夜，超声(250 W，40 kHz)10 min，滤过，弃去初滤液，续滤液备用。

2.4.2.3 标准曲线的绘制 分别精密量取没食子酸对照品溶液 0.030，0.070，0.20，0.40，0.80，1.0 mL 至25 mL量瓶中，加磷钼钨酸1.0 mL，再加水至13 mL，用7.5%Na2CO3定容至刻度，暗处放置3 h，以相应试剂溶液为空白，在763 nm处测定吸光度，以吸光度(Y)为纵坐标，没食子酸溶液浓度(X)为横坐标，建立回归方程:Y=114.8X+0.103，r=0.999 5，没食子酸浓度在0.386～12.9 μg/mL与吸光度线性关系良好。

2.4.2.4 样品含量测定 精密称取供试品，按2.4.2.2项下制备供试品溶液，精密量取2.0～25 mL量瓶中，按 2.4.2.3项下操作，自“加磷钼钨酸1.0 mL”起，在763 nm处测定吸光度，利用标准曲线法计算总多酚含量。结果见表2。

2.4.3 原儿茶酸和绿原酸的测定

2.4.3.1 色谱条件与系统适用性试验 Shim-pack-CLC-ODS(M)色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85)为流动相，流速0.6 mL/min;柱温25℃，检测波长260 nm/325 nm，进样量20 μL。在上述色谱条件下，原儿茶酸理论塔板数在4 000以上，与相邻组分色谱峰均达到完全分离，分离度大于1.5。

2.4.3.2 对照品溶液的制备 分别精密称取原儿茶酸对照品0.53 mg，绿原酸对照品0.69 mg，置于同一5 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得原儿茶酸浓度为0.106 mg/mL、绿原酸浓度为0.138 mg/mL的混合对照品。

2.4.3.3 供试品溶液的制备 分别精密称取2.2.5项下所得的不同极性部位各0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(250 W，40 kHz)20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过0.45 μm滤膜，备用。

2.4.3.4 样品含量测定 精密称取供试品，按2.4.3.3项下制备供试品溶液，按2.4.3.1项下的色谱条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，按外标一点法计算原儿茶酸和绿原酸含量。结果见表2。

2.4.4 齐墩果酸和熊果酸的测定

2.4.4.1 色谱条件与系统适用性试验 Shim-pack-CLC-ODS(M)色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，甲醇-水-冰乙酸-三乙胺(265∶35∶0.1∶0.05)为流动相，流速0.6 mL/min;柱温20℃，检测波长210 nm，进样量10 μL。在上述色谱条件下，齐墩果酸理论塔板数在15 000以上，齐墩果酸和熊果酸分离度达1.6。

2.4.4.2 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品和熊果酸对照品适量，分别置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解、稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.052 0 mg/mL的齐墩果酸对照溶液及0.125 mg/mL的熊果酸对照溶液。

2.4.4.3 供试品溶液的制备 分别精密称取2.2.5项下所得的不同极性部位各0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声(250 W，40 kHz)20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45 μm滤膜，备用。

2.4.4.4 样品含量测定 精密称取供试品，按2.4.4.3项下制备供试品溶液，按2.4.4.1项下的色谱条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，按外标一点法计算齐墩果酸和熊果酸含量。结果见表2。

表2 各极性部位得率及含量 %

3 讨论

本研究通过定性定量分析，明确了经AB-8大孔树脂分离的不同极性部位主要代表性成分;并在一次系统分离中对多糖、多酚和三萜酸均获得了有效的分离和富集。结果显示，宣木瓜药材75%乙醇提取物经AB-8大孔吸附树脂分离，可有效获得主要成分明确的三个极性部位:多糖类成分主要集中在水洗脱液中;多酚类成分主要集中在30%～50%乙醇洗脱液中;齐墩果酸、熊果酸等三萜类成分主要集中在95%乙醇洗脱液中，平行三份操作表明该方法具有良好的可重复性。

黄酮类成分被认为是木瓜的活性成分［11］，但本试验的化学鉴别及HPLC方法均未能在宣木瓜醇提物和各洗脱液中检识到文献报道的黄酮类成分，究其原因，一方面文献对黄酮类的分析多采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法［12］，该方法对黄酮的显色专属性不强［13］，误将多酚成分作为黄酮测定;另一方面可能是黄酮的存在形式和含量的原因，有待进一步研究。

由于篇幅所限，本文略去含量测定的方法学内容。多糖、多酚含量测定方法经典;原儿茶酸和绿原酸含量测定的方法学未在此赘述(另文发表)。齐墩果酸和熊果酸含量测定的方法学验证见文献［14］。

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