山羊源化脓隐秘杆菌的分离与鉴定及自然感染病例的病理学观察

张素辉，付利芝*，朱买勋，许国洋，徐登峰

(1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.重庆市山羊工程技术研究中心，重庆 402460)

山羊源化脓隐秘杆菌的分离与鉴定及自然感染病例的病理学观察

张素辉1，2，付利芝1，2*，朱买勋1，许国洋1，徐登峰1

(1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.重庆市山羊工程技术研究中心，重庆 402460)

为了确诊自然感染疑似化脓隐秘杆菌引起的山羊淋巴结炎病例病原，进行了病原菌分离培养、染色镜检、生化试验和16S rRNA鉴定、动物试验、病理组织切片观察。该病原菌染色镜检为革兰阳性的丝状、杆状或棒状细菌，VITEK2 Compact全自动微生物分析系统鉴定为化脓隐秘杆菌，可信度为88%，16S rRNA鉴定与化脓隐秘杆菌相似性高于99%，判定该病原菌为化脓隐秘杆菌；药敏试验结果显示该菌对β-内酰胺类药物和氟喹诺酮类药物有高度的敏感性，对磺胺类药物有一定的耐药性；病理切片观察到病羊心肌纤维变性，肺和肾小管管腔内有浆液-纤维素性变性，肝有炎性细胞浸润形成肝炎，肩前淋巴结脂肪变性，脾呈浆液-化脓性炎症。结果表明，本次致使山羊淋巴结炎的病原菌为化脓隐秘杆菌，且病羊病理组织学变化为主要脏器的化脓性炎症。

山羊；化脓隐秘杆菌；细菌学鉴定；16S rRNA鉴定；病理切片观察

化脓隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogenes)属于隐秘杆菌属成员，主要寄生在绵羊、山羊、猪、牛、野生反刍动物等动物的组织器官、黏膜和皮肤，并引起化脓性感染的一种条件性致病菌，感染该菌的动物表现为肺炎、关节炎、心内膜炎、乳腺炎、皮下脓肿等，怀孕母畜也可能伴有流产、死胎等现象，在产后母畜能引起子宫内膜炎等[1-2]，同时可能引起人感染致病[3]，给人类健康带来了重大的威胁。目前研究发现，化脓隐秘杆菌的毒力因子主要有溶血素(pyolysin，PLO)、胶原结合蛋白(CbpA)、神经氨酸酶(Nan)及菌毛合成蛋白(Fim)，这些毒力因子主要侵害动物红细胞、免疫细胞以及功能蛋白，降低机体免疫力，破坏免疫屏障，而常引起不同病原菌的混合感染[4]；在其治疗方面抗生素类药物均未收到良好的治疗效果，基于其毒力因子，有学者建立了PCR和ELISA诊断技术[5-6]，B.H.Jost等[7]研发了此病以胶原结合蛋白作为抗原的疫苗，但临床防治效果欠佳。目前国内尚未有感染化脓隐秘杆菌引起山羊淋巴结化脓的病例研究报道，作者以自然感染化脓隐秘杆菌引起淋巴结化脓的山羊为病例，进行了病原分离和鉴定以及病理学观察。

1 材料与方法

1.1 临床病例与样本采集

感染疑似化脓隐秘杆的发病山羊，来源于重庆市永川区某养羊场，病羊多为成年山羊，临床观察其病变主要是肩前淋巴结和股前淋巴结发生一处或多处鸡蛋大的脓疱(图1)，脓疱内脓汁质地均匀如牙膏状，呈白色至灰白色，无臭味。病羊精神沉郁，采食量下降，身体消瘦；怀孕母羊有流产现象。解剖取其发生脓肿的肩前淋巴结，发现其为大量结缔组织包裹，质地坚硬；脾和肺出现不同程度的出血。放血处死山羊，在无菌环境下，选择肩前淋巴结化脓液分离细菌，采集肺、肝、心、脾、肾和肩前淋巴结，置于4%甲醛溶液固定。

1.2 细菌鉴定

1.2.1 细菌学检查 在无菌环境下，选择肩前淋巴结化脓液接种在含10%小牛血清TSA琼脂培养基上，细菌纯化后，革兰染色镜检，观察其形态。

1.2.2 生化鉴定 将所纯化细菌送样至重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，应用VITEK2 Compact全自动微生物分析系统对分离菌进行系列生化鉴定。

1.2.3 细菌致病性试验 取健康昆明种小白鼠20只，随机分为2组，取菌液调整浓度至1×109CFU·mL-1，其中一组分别腹腔注射菌悬液0.2 mL·只-1，另一组为对照组，每只小鼠腹腔注射营养肉汤0.2 mL，接种后观察临床症状，对死亡动物进行剖解和细菌分离，重复试验3次。

1.2.4 病原菌16S rRNA的PCR扩增和测序及分析 按照试剂盒说明进行病原菌基因组DNA提取，参照文献[2]，采用细菌16S rRNA通用引物进行扩增和测序，上游引物5′-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物5′-CCCGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。所得序列在NCBI上使用Blast进行同源性搜索，采用MEGA 4软件中的邻接法，基于16S rRNA基因构建系统进化树。

1.2.5 药敏试验 参照美国临床实验室标准化委员会标准，采用标准纸片琼脂扩散法(K-B法)操作，检测该菌对氨苄青霉素等28种抗生素的敏感性，抑菌圈直径<10 mm表示其对抗生素具有一定的耐药性，10～15 mm的为中度敏感，>15 mm的为高度敏感。

1.3 病理切片检查

颈动脉放血处死山羊，无菌环境下采集病变组织，按常规方法进行病理学观察[8]。

2 结 果

2.1 细菌分离培养

从山羊肩前淋巴结的脓汁中分离到的细菌对营养要求较高，在普通琼脂平板上生长十分缓慢，培养72 h后仍观察不到菌落；在含小牛血清的TSA琼脂培养基上生长48 h后，可观察到直径大小约0.3 mm黏性菌落。挑取单个菌落于含小牛血清的TSB肉汤37 ℃振荡培养48 h后，试管底部出现黏性物质，振摇后肉汤呈均匀雾状。纯培养物革兰染色为阳性，镜检形态多样，呈丝状、杆状或棒状，单在或成丛，无明显链状存在(图2)。

2.2 生化鉴定结果

使用VITEK2 Compact全自动分析系统对病原菌进行生化鉴定，该菌为化脓隐秘杆菌，可信度88%，其生化鉴定结果见表1。

2.3 致病性试验结果

接种细菌的小鼠在24 h后出现精神萎靡，反应迟钝的症状，7 d后开始死亡，至第10天，死亡率达75%。剖检小鼠，发现其肝表面严重出血，出现大量化脓灶；肺大面积出血；肠道严重液化，腹腔布满化脓液，见图3。取肝和心血分离细菌，在兔血的TSA琼脂培养基培养48 h后，平板上均长出了与攻毒菌落一样的半透明、β-溶血、表面光滑、边缘整齐、灰白色小菌落，革兰染色为阳性，形态与注射小鼠前细菌形态一致，而未接种细菌组对照小鼠未出现死亡。

图1 山羊肩前淋巴结化脓Fig.1 Goat front shoulder lymph fester

图2 分离菌革兰染色结果，1 000×Fig.2 Gram stain results of isolates，1 000×

A.肝表面严重出血，化脓灶明显；B.肺大面积出血；C.肠道液化，腹腔布满化脓液A.Liver surface with hemorrhage and purulent lesions；B.Lung with a large area hemorrhage；C.Intestinal liquefaction and abdominal full of pus图3 小鼠病变器官Fig.3 Diseased organs in mice

表1 细菌生化鉴定结果

Table 1 Bacterial biochemical identification results

项目Items结果Results项目Items结果Results阴性控制-乳酸盐产碱-硝酸钾-杆菌肽耐受-吡嗪酰胺-焦谷氨酸⁃β⁃萘胺+2⁃萘基磷酸盐-萘酚⁃AS⁃BI⁃葡萄糖醛酸+2⁃萘基⁃βD⁃吡喃半乳糖苷-丙二酸盐+1⁃萘基⁃N⁃乙酰基⁃βD⁃氨基葡萄苷-明胶+七叶灵柠檬酸铁-葡萄糖+接触酶-核糖+尿素酶-2⁃萘基⁃αD⁃吡喃葡萄糖苷+甘露醇-木糖+磷脂酰磷脂酶C-蔗糖+6．5%氯化钠-乳糖+新生霉素耐受-β⁃葡萄糖醛酸酶+奥普托欣耐受-β⁃葡萄糖苷酸酶+磷酸酶-丙氨酸芳胺酶+

2.4 病原菌16S rRNA序列的扩增与分析

测序结果在NCBI上使用Blast进行同源性搜索，发现其与化脓隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogenes)相似性最高(高于99%)。基于16S rRNA基因，采用MEGA 4软件中的邻接法，将分离菌与隐秘杆菌属的伯纳德隐秘杆菌(Arcanobacteriumbernardiae)、溶血隐秘杆菌(Arcanobacteriumhaemo-lyticum)、化脓隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogenes)，放线菌属的牛放线菌(Actinomycesbovis)，动弯杆菌属的羞怯动弯杆菌(Mobiluncusmulieris)和柯氏动弯杆菌(Mobiluncuscurtisii)进行系统进化分析。结果发现，分离菌与隐秘杆菌属的伯纳德隐秘杆菌、溶血隐秘杆菌及化脓隐秘杆菌聚类，并与化脓隐秘杆菌形成一个进化分支。这表明分离菌与隐秘杆菌属的化脓隐秘杆菌的系统进化关系最近，见图4。

图4 化脓隐秘杆菌16S rRNA系统进化树Fig.4 Arcanobacterium pyogenes 16S rRNA phylogenetic tree

表2 药敏试验结果

Table 2 Susceptibility test results

药物名称Name药物含量/(μg·disc-1)Concentration抑菌圈直径/mmDiameter敏感性sensitivity药物名称Name药物含量/(μg·disc-1)Concentration抑菌圈直径/mmDiameter敏感性sensitivity先锋必75>40S先锋霉素Ⅵ3025．7S淋必治100>40S庆大霉素1024．6S氨苄西林10>40S奥复星523．8S头孢曲松30>40S诺氟沙星1022．0S头孢呋辛30>40S恩诺沙星519．2S阿奇霉素15>40S痢特灵30017．9S利福平5>40S培氟沙星1015．0M乙酰螺旋霉素30>40S红霉素150R先锋霉素Ⅴ3040S复方新诺明230R氟苯尼考7539．2S四环素300R强力霉素3036．5S洁霉素20R卡那霉素3032．6S甲氧苄啶50R丙氟哌酸530．8S克林霉素20R新霉素3026．3S磺胺异唑3000R

S.高度敏感；M.中度敏感；R.不敏感

S.Sensitive；M.Moderately sensitive；R.Insensitive

2.5 药敏试验结果

2.6 组织病理切片观察

病羊组织病理学变化参见图5～10。

图5 病羊心病理组织变化，心肌纤维严重断裂、变性，HE，400×Fig.5 The histopathologic changes of heart of sick goat，myocardial fibers were broken and degeneration，HE staining，400×

图6 病羊肺病理组织变化，肺泡壁上出现大量红细胞，肺泡腔内有浆液-纤维性异物，HE，100×Fig.6 The histopathologic changes of lung of sick goat，alveolar wall appared RBCs，the slurry filled with alveolar-fibrous foreign matter，HE staining，100×

图7 病羊肾病理组织变化，肾小管上皮细胞脱落，管腔内出现纤维样异物，HE，400×Fig.7 The histopathologic changes of kidney of sick goat，tubular epithelial cell loss and the lumen filled with fiber-like foreign matter，HE staining，400×

图8 病羊脾病理组织变化，大量脾淋巴细胞变性、坏死，坏死组织中充满脓细胞，HE，400×Fig.8 The histopathologic changes of spleen of sick goat，a large number of spleen lymphocyte degeneration and necrosis，necrotic tissue filled with pus，HE staining，400×

图9 病羊肝病理组织变化，肝内有局部坏死灶，肝细胞崩解，红细胞浸润，巨噬细胞等炎性细胞浸润，HE，400×Fig.9 The histopathologic changes of liver of sick goat，partial liver necrosis，hepatocytes disintegrated，RBCs and inflammatory cell infiltration，HE staining，400×

图10 病羊肩前淋巴结病理组织变化，淋巴细胞广泛坏死，大量红细胞和脂肪细胞浸润，HE，400倍×Fig.10 The histopathologic changes of lymph nodes of sick goat，lymphocytes extensive necrotized，RBCs and fat cell infiltration，HE staining，400×

病理组织切片显示，病羊心肌纤维大面积的断裂，严重变性，见图5；肺泡壁上出现大量红细胞，部分肺泡腔内出现浆液-纤维性异物，见图6；肾小管上皮细胞脱落，管腔内有纤维样异物出现，见图7；脾组织呈不同程度的变性、坏死，形成大小不等的化脓灶，化脓灶中大量的脓细胞聚集，呈浆液-化脓性病变，见图8；肝局部性出血，呈变质性肝炎，大量的肝细胞坏死，坏死灶内肝细胞崩解，炎性细胞浸润，周围肝组织出血，见图9。肩前淋巴结组织呈严重的脂肪变性，脂肪细胞弥散性地浸润淋巴组织，并伴有大量的红细胞，形成严重出血，见图10。

3 讨 论

化脓隐秘杆菌病是一种以化脓性炎症为主的传染病，而该菌属于条件性致病菌，在外界环境发生如气候、季节、长途运输、寄生虫感染和营养不良等因素的改变引起动物机体抵抗力降低时，带菌动物受到应激而诱发该病。本试验中，从病羊化脓淋巴结的脓汁中分离到的病原菌，应用VITEK2 Compact全自动微生物分析系统对进行系列生化鉴定其为化脓隐秘杆菌，其可信度为88%，其结果可能会因菌株传代次数、培养时间、人员观察等一些人为因素致使系统判断结果为假阳性[9]，同时，临床上未有动物感染化脓隐秘杆菌引起淋巴结炎的报道，故本病例未能经过细菌形态和生化鉴定而直接判断为化脓隐秘杆菌病。经16S rRNA鉴定后，与化脓隐秘杆菌(登陆号：FN394982)相似性高达99%，从分子生物学方面证实了该病原菌为化脓隐秘杆菌，结合临床及病理变化特点，最终确诊该病例为化脓隐秘杆菌引起的淋巴结炎。

药敏试验发现，化脓隐秘杆菌对β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素均属于高度敏感药物，对磺胺类药物具有一定的抗药性。但该病在临床上治疗效果不佳，其原因可能是由于化脓隐秘杆菌主要寄生在易感动物的黏膜和皮肤，药物不能够充分达到病灶部位，如试验中的高敏药物氨苄西林，其在反刍动物体内吸收较差，绵羊口服的生物利用度仅为2.1%，未能在临床上得到良好的治疗效果[10]。

山羊病理组织切片观察发现，病羊的肩前淋巴结和脾均出现了明显的坏死，大量坏死的中性粒细胞聚集，形成大小不等的化脓灶，从而判断该病原菌侵害了机体的免疫器官，先前未有相关的研究报道。化脓隐秘杆菌能产生溶血素(PLO)和神经氨酸酶(Nan)，PLO属于胆固醇依赖性的溶细胞素家族(family ofcholesteroldpendent cytolysin，CDC)成员，此类毒素通过在真核细胞上形成孔隙从而发挥其溶细胞活性，PLO能溶解包括红细胞、巨噬细胞在内的多种细胞，在血平板上形成特异的β-溶血；神经氨酸酶可以分解宿主细胞的唾液酸作为碳源，降低膜表面黏液的黏滞性，增强细菌对宿主的黏附、定植作用，便于病原菌进入深层组织等，同时神经氨酸酶的酸化作用增加了黏膜免疫球蛋白IgA对细菌蛋白酶的易感性，从而损害宿主的免疫应答[11-12]。进而可推断该病原致病原因可能是化脓隐秘杆菌分泌的PLO引起大量的细胞溶解，尤其是免疫细胞的溶解，同时在神经氨酸酶的影响下，大量的病菌深入动物免疫器官，使得免疫器官崩解，而淋巴结和脾属于机体的主要免疫器官，该菌侵袭这些免疫器官后，使组织形成病灶，故而在临床主要表现为明显的肩前和股前淋巴结炎。

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(编辑 白永平)

Isolation and Identification ofArcanobacteriumpyogenesfrom Goats and Pathological Observation of Naturally Infected Case

ZHANG Su-hui1，2，FU Li-zhi1，2*，ZHU Mai-xun1，XU Guo-yang1，XU Deng-feng1

(1.ChongqingAcademyofAnimalSciences，Chongqing402460，China；2.ChongqingEngineeringResearchCenterforGoat，Chongqing402460，China)

This study aimed to confirm the pathogens from purulent lymph goats infected naturally byArcanobacteriumpyogenes. The pathogens were isolated and cultured，identified by pathological method and 16S rRNA analysis.The result of bacterium analysis showed that the pathogen wasArcanobacteriumpyogenes，the credibility was 88% identified by VITEK2 Compact automated microbial analysis system and homology was 99% by 16S rRNA identification.The strain was highly sensitive to β-lactams antibiotics and fluoroquinolones，but resistant to sulfa drugs.Pathological sections showed the sick goat appeared myocardial fibrosis，lung and renal tubular lumen with serous-fibrinous degeneration，inflammatory cell infiltration induced hepatitis，spleen was serous-purulent inflammation and front lymph nodes near shoulders appeared steatosis.Thus we can summary that the pathogen of the goat lymphadenitis wasArcanobacteriumpyogenes.Histopathological changes were the main organs suppurative inflammation.

goat；Arcanobacteriumpyogenes；bacteriological identification；16S rRNA identification；pathological observation

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.017

2015-04-17

重庆市基本科研业务费专项(2014cstc-jbky-00108)；国家自然科学基金委员会青年基金项目(31402149)

张素辉(1980-)，女，汉族，四川广安人，副研究员，主要从事山羊疫病防控研究与推广

*通信作者：付利芝，E-mail：446116409@qq.com

S852.61

A

0366-6964(2015)12-2251-07