弓形虫截短SAG2基因的克隆表达与免疫活性分析

赵东岳，陈金锋，韦剑辉

(福建师范大学南方生物医学研究中心，福州 350117)

弓形虫截短SAG2基因的克隆表达与免疫活性分析

赵东岳*，陈金锋，韦剑辉

(福建师范大学南方生物医学研究中心，福州 350117)

构建截短的弓形虫表面抗原2(SAG2)原核表达系统，并探讨其抗原活性。PCR扩增去掉信号肽和C-末端的SAG2基因片段，插入原核表达载体pGEX-4T-3后转化到大肠杆菌DH5α，并用IPTG诱导。SDS-PAGE和Western blot鉴定重组SAG2t的表达及其免疫反应原性。每升菌液约纯化出4 mg rSAG2t蛋白；Western blot显示，ME49株感染的鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清均可强烈识别表达的截短SAG2蛋白。原核表达体系实现了截短的SAG2蛋白的可溶性表达，并具有良好的完全抗原活性。

弓形虫RH株/ME49株；免疫印记；截短SAG2基因

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是寄生在宿主有核细胞内的一种原虫，作为机会致病病原，引起人畜患病。弓形虫感染怀孕母畜后，侵害胎膜、侵染胎儿的大脑和肺[1]，可导致早产、流产、胎儿畸形，死胎。农场的贝类水生动物也有较高的弓形虫感染率[2]，因此弓形虫已经严重威胁人畜健康，弓形虫病的防治刻不容缓。弓形虫表面抗原2(SAG2)基因为单拷贝基因，无内含子，SAG2蛋白也具有1个游离的N-末端信号肽和疏水性的C-末端，被GPI锚定[3]。C.D.Yang等[4]诱导的嵌合蛋白rSAG1/2具有较强的免疫保护力；A.V.Machado等[5]制备的SAG2基因疫苗，能够强烈刺激宿主的体液免疫和细胞免疫，因此SAG2抗原具有较强的免疫原性。本研究利用去除信号肽和C-末端的SAG2(438 bp)基因序列进行克隆并在大肠杆菌内进行高效表达，以便制备快速、准确的抗体检测的相关试剂盒。

1 材料与方法

1.1 虫株、质粒

刚地弓形虫RH株由中国农业科学院兰州兽医研究所朱兴全教授友情提供；ME49株、原核表达质粒pGEX-4T-3，牛新孢子虫，均由福建师范大学黄晓红教授友情提供。

1.2 主要试剂

限制性内切酶EcoRⅠ、DL5000 DNA marker、DL2000 DNA marker、Primixed protein marker (Low)、TaKaRa ExTaq等均购自TaKaRa公司；PVDF膜购自Milipore公司；Giutathione sepharoseTM4B购自GE Healthcare公司；DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自美国Axygen公司；预染蛋白Marker 购自美国Thermo公司。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank (FJ825705)所登录的弓形虫RH株SAG2基因序列，用Primer5.0设计信号肽(N-末端)和C-末端切割点之间的序列，预计扩增438 bp。上下游引物的5′端添加限制性内切酶EcoRⅠ的识别位点和2个保护性碱基其序列分别为GAATTC和AC。由上海生工合成，引物序列如下，F：ACGAATTCGTCCACCACCGAGACG；R：ACGAATTCTTACTTGCCCGTGAGA。

1.4 截短SAG2片段的PCR扩增

以提取的RH株弓形虫全基因组为模板，根据TaKaRa ExTaq推荐的PCR反应体系进行优化，反应体系如下：TaKaRa ExTaq(5 U·μL-1)0.25 μL，10×ExTaqbuffer(Mg2+Plus) 5 μL，DNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1)4 μL，模板DNA 2 μL，上游引物(10 μmol·L-1)和下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL，灭菌蒸馏水加至50 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。扩增后的产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA，以备克隆。

1.5 重组质粒的克隆与鉴定

纯化回收的截短SAG2的PCR扩增片段与表达载体pGEX-4T-3分别用限制性内切酶EcoRⅠ酶切暴露出黏性末端，经1.5%的琼脂糖凝回收，并用紫外分光光度计测定浓度后，载体和目的基因SAG2t按照1∶3加样，与等体积的SolutionⅠ混匀，16 ℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布到含有100 μg·mL-1的氨苄青霉素LB固体琼脂培养基上37 ℃过夜培养12～16 h后用高纯质粒回收试剂盒回收重组质粒进行酶切鉴定。

1.6 重组蛋白SAG2t的诱导表达、纯化

挑取1个含有pGEX-4T-3-SAG2t重组表达质粒的单克隆接种到含Amp(工作质量浓度100 μg·mL-1)的LB培养基，过夜培养12～16 h，过夜培养的菌液按照1∶100的比列接种到含有Amp的LB培养基37 ℃摇培，当OD600 nm为0.6～0.8时加入IPTG(工作浓度0.5 mmol·L-1)进行诱导，在优化的最佳诱导温度25 ℃的条件下诱导4 h。离心收集菌体细胞，用4 ℃预冷TNE(含50 mmol·L-1Tris-Hcl pH8.0，150 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA)按照1∶50的比例悬浮菌体，并加入溶菌酶(工作质量浓度100 μg·mL-1)静置一段时间后，经超声破碎后，加入TritonX-100(工作浓度1%) 冰上放置30 min，促进蛋白质的溶解，离心后获得可溶相和不可溶相。可溶相纯化步骤按照Glutathione SepharoseTM4B(GE Healthcare)说明书操作。最后将可溶相，不可溶相，纯化的产物进行SDS-PAGE分析。

1.7 Western blot分析

1.7.1 抗rSAG2t鼠血清的制备 由于rSAG2t含有GST标签蛋白，所以免疫小鼠时做GST对照。GST是由含有pGEX-4T-3质粒的大肠杆菌经IPTG诱导表达产生，粗提及纯化方法同1.6。试验组小鼠注射100 μg的rSAG2t，对照组注射100 μg的GST。初次免疫：将500 μg蛋白质稀释成1 000 μL，与等体积的弗氏佐剂进行乳化，分成5等分，分别注入5只小鼠腹腔；加强免疫：2周后以同样的剂量蛋白悬液与等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化后腹腔注射，再间隔2周后同样的剂量、同方法再次加强免疫，10 d后颈总动脉取血，分离抗rSAG2t鼠血清。1.7.2 感染弓形虫ME49株鼠血清制备 Vero细胞培养的弓形虫弱毒株ME49虫体，用PBS洗三遍，腹腔注射500只速殖子，感染前及感染后第7、10、14、20、27、38、45、54天分别经小鼠尾部取血，分离血清。

1.7.3 重组蛋白SAG2t的Western blot分析 纯化rSAG2t蛋白进行SDS-PAGE分析，分离胶和浓缩胶的浓度分别是12%和5%，每块胶在恒流25 mA条件下电泳进行浓缩，进入分离胶时转化电流为50 mA，待溴酚蓝指示剂移到接近凝胶底部时立即停止电泳，然后电转印PVDF膜(湿转印条件：每块胶恒压120 V，转印60 min)；用5%的牛血清白蛋白(2.5 g，BSA用50 mL，1×TBST溶解)进行封闭；一抗：分别是弓形虫感染的鼠血清和rSAG2t抗原免疫的鼠血清(1∶100稀释)；二抗：标记红色荧光的抗鼠IgG抗体(1∶3 000)稀释。

1.8 重组蛋白SAG2t为包被抗原的ELISA检测

用重组SAG2t包被酶标板，用ELISA方法分析感染弓形虫ME49株的SPF鼠血清、SPF鼠阴性血清、感染新孢子虫的SPF鼠血清，分析其抗原识别的特异性及其ME49株感染小鼠后特异性IgG抗体水平消长动态。

2 结 果

2.1 截短SAG2的扩增

从弓形虫RH株全基因组DNA中扩增的截短SAG2t(438 bp)基因片段，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，发现在500 bp左右有一条清晰明亮的条带(图1)，与预期结果相同。

M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1. SAG2t片段；2.阴性对照M.DL2000 DNA marker；1.The fragment of SAG2t；2.Negative control图1 去除信号肽和C-末端的SAG2编码基因的扩增结果Fig.1 The amplification of encoding gene of SAG2 without signal peptide and c-terminal

2.2 重组质粒的酶切鉴定

pGEX-4T-3-SAG2t重组质粒进行PCR 扩增和酶切后，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在500和5 000 bp附近有两条清晰明亮的条带(图2)。

M.DL5000 DNA相对分子质量标准；1.阴性对照；2.阳性对照；3.重组质粒的PCR鉴定；4.重组质粒pGEX-4T-3-SAG2t；5.pGEX-4T-3-SAG2t 重组质粒酶(EcoRⅠ)切产物M．DL5000 DNA marker；1.Negative control；2.Positive control；3.Identification of recombinant plasmid pGEX -4T-3-SAG2t by PCR；4.Recombinant plasmid of pGEX-4T-3-SAG2t；5.Identification of recombinant plasmid pGEX-4T-3-SAG2t by EcoRⅠ图2 重组质粒pGEX-4T-3-SAG2t-PCR和双酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pGEX-4T-3-SAG2t by PCR and restriction enzyme digestion

2.3 重组蛋白SAG2t的表达、纯化及Western blot分析

将rSAG2t的表达和纯化结果进行SDS-PAGE电泳后分析发现，rSAG2t的相对分子质量与预测的41 ku相符；rSAG2t产量很高，粗略估计每升菌液中约纯化出4 mg高纯度的抗原，见图3。

M.蛋白质相对分子质量标准；1.上清；2.沉淀；3.纯化的重组蛋白质；4.GST对照；5～10.BSA，质量浓度分别为62.5、125、250、500、1 000和2 000 μg·mL-1M.Proteins with standard molecular mass；1.Soluble fraction；2.Insoluble fraction；3.Purified rSAG2t；4.GST；5-10.BSA with the concentration of 62.5，125，250，500，1 000 and 2 000 μg·mL-1图3 SDS-PAGE分析rSAG2t的表达与纯化结果Fig.3 The expression and purification of rSAG2t by using SDS-PAGE analysis

Western blot显示，感染弓形虫ME49株的鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清均可强烈识别表达的截短SAG2蛋白，但是两者均不与GST蛋白发生免疫反应，见图4。

M.预染蛋白质相对分子质量标准；1.rSAG2t抗原+感染ME49株鼠血清；2.rSAG2t抗原+rSAG2t免疫鼠血清；3.GST抗原+感染ME49株鼠血清；4.GST抗原+rSAG2t免疫鼠血清M.Prestained-protein marker；1.rSAG2t+serum infected with T.gondii ME49 strain；2.rSAG2t+serum immunized by rSAG2t；3.GST+serum infected with T.gondii ME49 strain；4.GST+serum immunized by rSAG2t 图4 Western blot分析显示重组蛋白rSAG2t分别与感染ME49株鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清起强烈的抗原抗体反应Fig.4 rSAG2t reacted strongly between serum infected with T.gondii ME49 strain and serum immunized by rSAG2t using Western blot analysis

2.4 重组蛋白SAG2t为包被抗原的ELISA检测

由图5可见，rSAG2t(2 μg·mL-1)包被酶标板进行ELISA，发现感染弓形虫ME49株的SPF鼠血清OD值升高，SPF鼠阴性血清和感染牛新孢子虫的鼠血清OD值未升高，表明rSAG2t能够特异性检测出感染弓形虫的抗体。图6显示，用ELISA追踪感染ME49株小鼠血清在7～54 d的特异性IgG抗体水平消长动态，在感染7 d后可检测到弓形虫特异性IgG抗体，20 d后弓形虫特异性IgG抗体水平达到高峰，随后虽有所下降，但还是维持在较高的水平，该结果与IgG抗体水平消长的规律相符。

图5 rSAG2t特异性试验Fig.5 The specific test of rSAG2t

A、B、C、D、E、F、G、H.感染7、10、14、20、27、38、45、54 d特异性IgG抗体滴度A，B，C，D，E，F，G，H.Specific IgG antibody titers at 7，10，14，20，27，38，45 and 54 days post infection图6 感染ME49株弓形虫小鼠特异性IgG抗体消长动态Fig.6 Dynamic specific IgG antibody levels in T.gondii ME49-infected mouse

3 讨 论

S.Tomavo等研究发现SAG2的N-端信号肽序列和C-末端脂锚锭蛋白具有高度的疏水性[6]。龙彩虹等构建pGEX-4T-2-SAG2t，在E.coliDH5α中诱导出去除前导信号肽的SAG2(477 bp)[7]。雷明军等构建重组表达质粒pET23a-SAG2，在E.coliDH5α中诱导全长SAG2(500 bp)[8]。黄燕等构建pGEX-4T-SAG2t，在E.coliDH5α中诱导出去除疏水性信号肽的SAG2(451 bp)[9]。聂福旭等构建重组质粒pET23a-SAG2t，在E.coliBL21内诱导出去除前导信号肽的SAG2[10]。S.Li等利用基于rSAG2构建的rELISA方法，能够特异性地应用于孕妇弓形虫的检测，可有效区分急、慢性感染[11]。Y.L.Lau等在毕赤酵母中成功克隆、表达出去掉一半N-末端的SAG2，并且能够识别感染弓形虫的血清[12]。Y.L.Lau等在毕赤酵母中表达出全长SAG2抗原蛋白，构建检测人弓形虫病ELISA方法不仅能够检测急性感染患者(IgM+、IgG-)，也能够检测慢性感染患者(IgM-、IgG+)[13]。

从上述文献的报道来看，SAG2抗原蛋白，能够特异性的识别感染弓形虫的动物血清中IgM抗体和IgG抗体，但是上述文献中所报道的SAG2抗原蛋白的表达量仍然比较低，为了提高SAG2抗原在大肠杆菌内高产量的表达，本研究根据SAG2基因序列的特点，去除疏水性的信号肽序列和C-末端序列SAG2(438 bp)亚克隆到高效表达载体pGEX-4T-3，并转化到E.coliDH5α中进行高效诱导，结果表明每升菌液中可纯化出的量高达4 mg。在试验的过程中发现，IPTG的诱导终浓度在0.1～0.5 mmol·L-1之间诱导的量没有明显差异，与以上文献报道的最佳IPTG浓度为0.1 mmol·L-1有所出入；试验中还发现诱导的温度对SAG2蛋白表达有至关重要的影响，本试验优化的最佳诱导温度为25 ℃时表达量最高，也与以上文献报道的有所不同，究其原因可能与表达载体有密切关系。

SAG2t具有较高的敏感性和特异性，不与亲缘关系近的新孢子虫(N.caninum)发生交叉反应，并且能够强烈刺激宿主的体液免疫产生较高的抗体水平，这为今后进一步改良快速免疫色谱试验进行弓形虫感染的免疫诊断奠定了基础；同时抗重组蛋白抗体也可用于弓形虫侵入宿主细胞的分子机制研究。另一方面将SAG2t蛋白与GST表达成融合蛋白，用亲和层析的方式纯化到可溶性蛋白质，克服了产量少、难纯化的缺点，为弓形虫SAG2蛋白的进一步研究奠定基础。综上所述，本试验成功的克隆弓形虫编码的SAG2基因片段，并在大肠杆菌中高效表达，重组蛋白质具有良好的抗原性和免疫原性，具有潜在的应用价值。

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(编辑 白永平)

Prokaryotic Soluble Expression of Truncated SAG2 Protein of

Toxoplasmagondiiand Its Antigenic Activity ZHAO Dong-yue*，CHEN Jin-feng，WEI Jian-hui

(SouthernBiomedicalResearchCenteratFujianNormalUniversity，Fuzhou350117，China)

To expressSAG2 gene ofToxoplasmagondiiby prokaryotic expression system and to identify its antigenicity，truncatedSAG2 without the highly hydrophobic signal peptide and C-terminus were amplified by PCR，and recombinant prokaryotic expression plasmid (pGEX-4T-3-SAG2t) with SAG2t protein gene was constructed.Then the recombinant plasmids were transferred intoE.coliDH5α，and the bacteria were induced by IPTG.The expression and immune-reactivity of SAG2t protein were detected by SDS-PAGE and Western blotting respectively.The yield of purified rSAG2t was more than 4 mg per liter of culture medium.Western blot showed that rSAG2t can be strongly recognized by mice serum infected withT.gondiiME49 strain and mice serum immunized by rSAG2t .The result showed that the soluble expression of SAG2t protein with favorable complete antigenic activity was implemented by prokaryotic expression system.

RH/ME49 strain ofToxoplasmagondii；Western blot；truncatedSAG2

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.018

2014-10-11

国家卫生和计划生育委员会科研基金(WKJ-FJ-28)

赵东岳(1985-)，山东高青人，硕士，实验师，主要从事动物病原与分子生物学研究，E-mail:296158826@qq.com

*通信作者：赵东岳，Tel：0591-22868832，E-mail：mountainous@163.com

S852.729

A

0366-6964(2015)12-2258-06