小鼠Sca-1阳性心脏内源性干细胞的分离、扩增及标记物观察

刘平平，李文静，常芬，赵静，井庆川( 滨州医学院烟台附属医院，山东烟台64000;山东大学生命科学学院; 山东省农业科学院家禽研究所)

小鼠Sca-1阳性心脏内源性干细胞的分离、扩增及标记物观察

刘平平1，李文静2，常芬2，赵静2，井庆川3
( 1滨州医学院烟台附属医院，山东烟台264000;2山东大学生命科学学院; 3山东省农业科学院家禽研究所)

摘要:目的分离、扩增干细胞抗原1( Sca-1)阳性心脏内源性干细胞，并观察其标记物情况。方法取C57BL/6小鼠心肌组织，用磁珠分选法分离Sca-1阳性内源性心脏干细胞，并对其传代扩增。观察初分离及传代过程中细胞形态的变化，用流式细胞仪检测初分离及扩增后(第5代) Sca-1阳性心脏干细胞阳性率，以RT-PCR法检测Sca-1阳性及阴性心脏干细胞肌球蛋白重链6( MYH6)、肌钙蛋白T( cTnT)、心肌转录因子4( GATA4)标记物的表达。结果初分离的Sca-1阳性心脏干细胞为圆形，比血细胞小;传代后细胞呈现星形，伸出较长的伪足，第5代后形状差异不大。原代、第5代心肌细胞Sca-1阳性心脏干细胞阳性率分别为81.0%±10.4%、90.0%±5.0%，P ＞0.05; Sca-1阳性心脏干细胞MYH6、cTnT、GATA4相对表达量分别为0.50±0.21、0.72±0.04、0.72±0.05，阴性心脏干细胞分别为0.20±0.02、0.86±0.06、0.71±0.05，两者MYH6、cTnT比较，P均＜0.05。结论成功分离出Sca-1阳性心脏干细胞，且传代稳定、纯度较高，高表达MYH6。

关键词:心脏干细胞;肌球蛋白重链6;肌钙蛋白T;心肌转录因子4;磁珠分选法

Isolation，amplification and marker observation of Sca-1 positive cardiac stem cells in mice

LIU Ping-ping1，LI Wen-jing，CHANG Fen，ZHAO Jing，JING Qing-chuan
( 1Yantai Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Yantai 264000，China)

Abstract:Objective To isolate and amplify the Sca-1 positive cardiac stem cells from C57BL/6 mice in vitro and to observe its markers.Methods The myocardial tissues from C57BL/6 mice were selected，and we separated the Sca-1 positive cells by the magnetic cell sorting and amplified its passage.We observed the morphology changes in the culture process.The flow cytometry was used to test the Sca-1+purity of the primary and fifth generation of myocardial cells.RTPCR was used to detect the expression of multiple factors ( MYH6，cTnT and GATA4) in the isolated Sca-1 positive cells and negative cells.Results The primary cultured Sca-1 positive cells were round，smaller than blood cells; the sub-cultured were starlike，and the pseudopodia were long，and after the fifth generation，the morphology of cells showed little difference.The Sca-1+positive rates of primary and the fifth generation were 81%±10.4% and 90%±5%，separately ( P＞0.05).The relative expression of MYH6，cTnT and GATA4 in Sca-1+cells was 0.5±0.21，0.72±0.04 and 0.72 ±0.05，separately; while the expression in the Sca-1－cells was 0.2±0.02，0.86±0.06 and 0.71±0.05.Significant difference was found in the expression of MYH6 and cTnT ( all P＜0.05).Conclusion Sca-1 positive cardiac stem cells can be isolated successfully and sub-cultured stablely.Furthermore，Sca-1+cells show high expression of MYH6.

Key words:cardiac stem cells; myosin heavy chain 6; troponin T; myocardial transcription factor 4; magnetic cell sorting

研究认为，心肌细胞数量减少是缺血性心脏病患者死亡的主要病理学因素［1］。干细胞移植是治疗缺血性心脏病的有效途径，内源性心脏干细胞被认为是修复损伤心肌最合适的干细胞类型［2］。Sca-1阳性心脏干细胞即是一种内源性心脏干细胞，可在成体心脏中分离。研究发现，将该细胞移植到小鼠心脏梗死周边区后，可分化为心肌细胞，促进周围血管新生，改善左心室功能［3］。因此，分离并获

取高纯度、足够数量的Sca-1阳性细胞十分关键。2014年1月～2015年6月，我们以C57BL/6小鼠为标本，分离、扩增Sca-1阳性心脏内源性干细胞，并观察其标记物情况。

1　材料与方法

1.1材料10周龄C57BL/6小鼠12只，雌雄不限，体质量25～30 g，由山东大学动物实验中心提供，于25℃恒温、无菌饲养。胶原酶、胰酶干粉、EDTA、牛血清白蛋白(上海生工)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，磁珠、Sca-1抗体(美国BD公司) ;培养皿、CO2培养箱(美国赛默飞世尔科技有限公司)，细胞培养板(美国Corning公司)，血球计数板(盐城市恒泰玻璃仪器厂) ; TS 100倒置相差显微镜(日本Nikon)，冷冻高速离心机(德国Sigma公司)，DYCP-31DN型琼脂糖水平电泳仪(北京市六一仪器厂)，FA1204B电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)，BLOCK HEATERS(海门市其林贝尔仪器有限公司)，FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)，磁力架( Promega公司)。

1.2 Sca-1阳性心脏干细胞的分离及培养将小鼠断颈处死，迅速取出心脏，清洗，剪碎至1 mm3大小。37℃下以0.01%胰酶及0.1%胶原酶混合液消化30 min，加入500 μL胎牛血清终止消化，200目细胞筛过滤。将滤液350 g离心8 min，用细胞染色缓冲液重悬细胞，使其密度达2×107/mL。向溶液中加入生物素标记的Sca-1抗体，每1×107个细胞加5 μL，冰上孵育20 min。用1×BD buffer洗涤标记的细胞，350 g离心8 min，除去未结合的抗体。每1×107个细胞加25 μL亲和链霉素标记的磁珠，混匀，4℃孵育45 min。用1×BD buffer洗涤细胞，至细胞浓度为( 20～80)×106/mL。将盛有细胞的EP管放置到磁力架上，Sca-1阳性心脏干细胞会通过结合的Sca-1抗体结合到磁珠上，从而被吸附到EP管管壁。吸出上清，再次加入1×BD buffer，重复细胞吸附这一步骤4次，以得到较纯的Sca-1阳性心脏干细胞。最后一次吸附完成后，用加入含10 μg/mL生长因子和10%胎牛血清的IMDM 1 mL，悬浮Sca-1阳性心脏干细胞;并将其移入24孔板内，37℃、5% CO2培养箱培养。

1.3 Sca-1阳性心脏干细胞的扩增细胞长满24孔板后吸走废液，10 mL PBS洗涤2次。每孔加入0.1 mL胰酶。倒置显微镜观察贴壁细胞变圆时，吸走胰酶，加入新的IMDM培养液，混匀吹打质细胞悬浮。把细胞分至新的培养皿中，放到培养箱中培养。

1.4相关指标观察

1.4.1 Sca-1阳性心脏干细胞形态观察将原代、传代Sca-1阳性心肌干细胞分别接种于24孔板中，待细胞长满后将其均匀转入小皿中，用含有生长因子和10%胎牛血清的IMDM培养，换液1次/3 d，培养2～3周后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。1.4.2 Sca-1阳性心脏干细胞传代稳定性观察分别取心肌的原代、第5代细胞制成细胞悬液( 1× 106/mL)，300 g离心5 min去除废液;用cell staining buffer重悬细胞，加入PE-Cy5-CD45抗体，FITC-Sca-1阳性抗体，PE-CD34抗体冰上染色30 min; 300 g离心5 min，PBS洗2次;最后再次加入cell staining buffer重悬细胞，利用流式细胞术检测，Devove软件计算原代、第5代Sca-1阳性心脏干细胞阳性率。

1.4.3 Sca-1阳性心脏干细胞标记物观察分别取Sca-1阳性、阴性心脏干细胞，采用RT-PCR法检测细胞标记物，包括肌球蛋白重链6( MYH6)、肌钙蛋白T( cTnT)、心肌转录因子4( GATA4)。标记物引物序列均参考文献［4］设计合成，检测均按使用说明书进行。以β-actin作为内参，以目标条带与内参条带吸光度比值作为标记物相对表达量。

1.5统计学方法采用SPSS20.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，数据比较采用配对样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 Sca-1阳性心脏干细胞形态初分离的Sca-1阳性心脏干细胞形态为未贴壁的细胞，细胞为圆形，比血细胞小。分离后第3天Sca-1阳性心脏干细胞开始贴壁，第7天长到皿底面积的40%，约2周长满后可正常传代培养。以后3～4 d传代1次。贴壁后细胞呈现星形，伸出较长的伪足。第5次传代后形状差异不大。

2.2 Sca-1阳性心脏干细胞传代稳定性原代、第5代心肌细胞Sca-1阳性心脏干细胞阳性率分为别81.0%±10.4%、90.0%±4.5%，P＞0.05。

2.3 Sca-1阳性心脏干细胞的标记物Sca-1阳性心脏干细胞MYH6、cTnT、GATA4相对表达量分别为0.50±0.21、0.72±0.04、0.72±0.05，阴性心脏干细胞分别为0.20±0.02、0.86±0.06、0.71± 0.05，两者MYH6、cTnT比较，P均＜0.05。

3　讨论

以往研究认为，成年哺乳动物的心脏是静止不变的器官，心肌细胞、内皮细胞等心脏的组成部分均在出生后即停止克隆增殖、分化，心脏损伤后不能完全修复再生。但近年来这一观点受到了很大挑战。2002年，Hierlihy等［5］从小鼠心脏分离出具有干细

胞活性的维拉帕米敏感的心脏边缘群细胞，与新生心肌细胞在体外共同培养可使其分化为心肌细胞，首次证实了心脏内源性再生机制。Beltrami等［6］证实，成年小鼠的心脏中存在可自我更新、克隆及多潜能分化的心肌细胞，推测心脏中存在心脏干细胞。研究发现，心脏干细胞主要聚集于心房及房室交界处，在适宜刺激条件下可分化形成心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等［7，8］。根据细胞生物学标志，可以将心脏干细胞分为c-kit阳性细胞、侧群细胞、Islet-1阳性心肌祖细胞、Sca-1阳性心脏干细胞。c-kit+心脏干细胞是最早发现的心脏干细胞，临床研究较早但其分离、纯化、扩增非常困难，限制了其临床应用范围;而SP心脏干细胞的获取周期较长，体外研究较困难［9］。

Sca-1是Ly-6家族的成员之一，最早被作为造血干细胞的表面标记物［10］。最近许多报道表明骨髓、骨骼肌及胚胎干细胞中都有Sca-1阳性多能干细胞，能分化为肝细胞、神经细胞、内皮细胞及骨骼肌、平滑肌细胞，表明Sca-1阳性在体细胞分化中起重要作用［11，12］。Sca-1阳性心脏干细胞是心脏中所占比例最高的一种干细胞，它可以向内皮细胞和心肌细胞分化［13］。研究发现，Sca-1基因敲除可阻止心脏干细胞分化为心肌细胞，将Sca-1阳性心脏干细胞注射到缺血再灌注动物模型中，可观察到其分化为心肌细胞，使心脏泵血能力改善［14］。

既往文献报道干细胞分离、纯化及扩增方法偏少，初分离的心脏干细胞数量少，传代后心脏干细胞质量不稳定，Sca-1阳性心脏干细胞阳性率与刚分离的干细胞相比有显著差异，而且实验重复成功率低。本研究为Sca-1阳性心脏干细胞的体外培养提供了基础。且5代以内干细胞性质稳定，和原代细胞相比没有显著差异。

GATA4是心肌分化早期的标志性基因，MYH6、cTnT是成熟心肌细胞的标志性基因。由于Sca-1阳性心脏干细胞能够分化为心肌细胞［15，4］，我们对这几个基因的表达情况进行了分析。PCR结果表明，Sca-1阳性心脏干细胞高表达MYH6，可能是Sca-1阳性干细胞更容易分化为心肌细胞的主要原因。Sca-1基因如何促进了MYH6的高表达还有待进一步研究，但是MYH6可以作为鉴定Sca-1阳性干细胞的辅助指标。

综上所述，采用磁珠分选法体分离、纯化及扩增的Sca-1阳性心脏干细胞，具有培养操作过程简单、重复成功率高、多次传代细胞特性稳定的优点。

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收稿日期:( 2015-06-01)

通信作者简介:井庆川( 1975-)，男，副研究员，研究方向为动物营养。E-mail: zhaojingqch@163.com

作者简介:第一刘平平( 1977-)，男，主治医师，研究方向为冠心病介入及基础。E-mail: ppl300@126.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目( 31371158)。

文章编号:1002-266X( 2015) 30-0014-03

文献标志码:A

中图分类号:R541

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.005