面筋中腐败微生物的分离和鉴定的研究

许喜林，邹彦桐，王蔚瑜

（华南理工大学 轻工与食品学院，广东 广州 510640）

面筋是生产淀粉的副产品，含有丰富的植物蛋白质资源，很早就被人们广泛食用，1745年意大利科学家BECCAI就发现了面筋[1]。面筋是一种复杂的蛋白质复合物，是小麦能够制成特有食品的物质基础[2]。对于许多素食主义者来说，动物蛋白的摄入量较少，因此面筋变得尤为重要，目前面筋在西方国家也逐渐进入市场。面筋制品在保证人群营养均衡，特别是对于蛋白质的摄取具有非常重要的意义[3]。

由于面筋的营养成分尤其是蛋白质的含量较高，为微生物提供了良好的生长条件，一旦加工中杀菌不彻底或者储藏条件不当，就极易引起面筋的腐败变质，影响面筋的品质，使得面筋产品的保质期变短。因此，研究面筋中的腐败微生物具有意义。本研究对面筋中的腐败微生物进行分离纯化，通过菌落观察，革兰氏染色，V-P试验等方法从形态学和生理生化特性上初步鉴定了导致面筋腐败的主要腐败生物，为面筋产品的防腐保藏提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

面粉：山东鲁王集团有限公司。

1.1.2 试剂

氯化钠（分析纯）：江苏强盛功能化学股份有限公司；琼脂：厦门星隆达化学试剂有限公司；氯霉素（分析纯）：湖北众诚药业有限公司；葡萄糖、氧化酶试纸、V-P试剂、革兰氏染色试剂、胰蛋白胨、硝酸盐：广州环凯微生物科技有限公司；磷酸氢二钾（分析纯）：天津市启联精细化学有限公司；磷酸氢二铵（分析纯）：天津福晨化学试剂厂；氯化钾（分析纯）、硫酸镁（分析纯）：广州化学试剂厂；可溶性淀粉（化学纯）：江苏强盛功能化学股份有限公司；丙酸钙（分析纯）：天津市永大化学实际开发中心；酵母膏：上海中科昆虫生物技术开发有限公司；D-木糖、甘露醇：上海伯奥生物科技有限公司。

1.1.3 培养基

分离和计数培养基：营养琼脂培养基（nutrient agar，NA）、平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、固体马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、孟加拉红（虎红）琼脂培养基。

生化鉴定培养基：营养肉汤培养基（nutrient broth，NB）、V-P试验培养基、芽孢菌培养基、淀粉水解培养基、明胶水解培养基、硝酸盐还原实验培养基、柠檬酸盐实验培养基、丙酸盐培养基、吲哚实验培养基等，按照《常见细菌系统鉴定手册》[4]和《食品微生物实验室手册》[5]配制。

1.2 仪器与设备

pHS-25型精密pH计：上海精密科学有限公司；JJ3000型电子天平：广州市芊荟化玻璃仪器有限公司；XSP-3CA型单目生物显微镜：上海光学仪器六厂；DK-S24型电热恒温水浴锅：广东环凯微生物科技有限公司；WMK-02型电热恒温培养箱：南京实验仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 面筋的制作工艺

面粉/水（质量比5∶2）→和面→醒发（室温静置30 min）→制取（淋水揉洗3～5次）→面筋[6]。

1.3.2 面筋中微生物生长状况研究

将湿面筋切成大小均匀的块状，分别采用100℃、110℃、120 ℃灭菌30 min处理。称取不同温度下灭菌的一定质量的面筋，加水均质，稀释至相邻3个梯度浓度，吸取1 mL的不同浓度的稀释液分别倒入灭菌后冷却至45～50 ℃的PDA培养基、虎红培养基和营养琼脂培养基。然后酵母菌和霉菌培养基放置28 ℃中恒温培养3～5 d，细菌培养基在36 ℃中培养24 h观察结果。

称取面筋5 g，放入45 mL的无菌水中，均质并稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5共5个稀释梯度，吸取1 mL稀释液到培养皿，倾倒经灭菌后冷却至45～50 ℃的PCA培养基，每个稀释度做3个平行。凝固后在36 ℃的培养箱中培养48 h进行计数[7]。

1.3.3 面筋中腐败微生物的分离纯化与腐败验证

在无菌条件下，称取变质面筋5 g置于45 mL的无菌水中，均质并稀释至10-1、10-2、10-3，吸取1 mL倾倒至经过121 ℃灭菌冷凝的营养琼脂培养基，于36 ℃的培养箱中培养24 h，然后挑取可疑菌落进行反复划线直至分离出单菌落。

挑取所有可疑菌落接种于经过120 ℃灭菌30 min的面筋中，放置于36 ℃的培养箱中培养，每隔12 h观察面筋的感官情况[8]，是否出现颜色变深、黏稠、恶臭气味等腐败现象。按照上述方法，对面筋进行菌落总数计数。

1.3.4 面筋中腐败微生物的观察及生理生化鉴定

在无菌条件下，将已经融化并冷却到40～50 ℃的营养琼脂培养基按无菌操作倒入培养皿中，冷却凝固后，用无菌接种环取少许菌在平板表面划线，以便长出单菌落。在36 ℃在培养24 h，然后观察以下特征：单菌落的颜色、大小和形状、透明度、边缘、表面突起形状、黏稠度和气味等。对于分离出来的18株菌进行分类鉴定，根据《常见细菌系统鉴定手册》[4]、《伯杰细菌鉴定手册》[9]、《食品微生物实验室手册》[5]中提供的方法，鉴定项目包括菌落的形态特征和生理生化特征[10]。

2 结果与分析

2.1 面筋中微生物生长状况研究

采用营养琼脂培养基、PDA培养基、虎红琼脂培养基，对腐败面筋进行微生物培养，各种培养基表面微生物的生长情况如表1所示。

表1 细菌和真菌培养基中微生物生长情况Table 1 The microorganisms growth in bacterial and fungal mediumCFU/g

由表1可知，经过不同温度灭菌的面筋样品经过24 h的放置后进行微生物培养，添加氯霉素的固体PDA培养基和虎红培养基都没有微生物生长，而在营养琼脂培养基中，经过120 ℃灭菌30 min的面筋没有微生物生长，而100 ℃、110 ℃灭菌30 min处理的面筋微生物生长良好，菌落近圆形，呈乳黄色或乳白色，直径2～6 mm，表面粗糙干燥或湿润黏稠，半透明或不透明，边缘形态各异，基本判断是面筋中的腐败微生物。

2.2 面筋中腐败微生物的分离纯化与腐败验证

在面筋腐败微生物分离的研究中，经过反复划线分离共挑取18株单菌落可疑菌。在腐败验证试验中，每一株可疑菌分别接入经过120 ℃灭菌30 min的面筋中，同时以不接种细菌作为对照，在36 ℃培养24 h后观察现象，结果见表2。

表2 面筋腐败验证实验结果Table 2 The verification test results of wheat gluten spoilage

由表2可知，空白对照保留面筋原有的奶黄色，而其他所有面筋表面有明显的白色絮状物质生长，面筋颜色由乳黄色变为深色，并且都产生刺鼻的臭味。对面筋进行菌落总数计数，每组面筋的菌落总数都超出国家标准（≤1×105CFU/g）[11]。

2.3 面筋中腐败微生物的观察及生理生化鉴定

通过种水平和属水平的生理生化鉴定结果，确定菌株No.1、No.5、No.6、No.14、No.16、No.17为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），菌株No.2、No.3、No.4、No.7、No.8为蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoidesFlugge），菌株No.9、No.11、No.12、No.13、No.15为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），菌株No.10、No.18为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。选取菌株No.1、No.3、No.9、No.18为代表菌，菌落形态见图1所示。

图1 面筋腐败微生物的菌落形态Fig.1 The morphology characteristics of the spoilage microorganisms in wheat gluten

由图1可知，菌株No.1，菌落呈近圆形，直径3～4 mm，边缘呈锯齿状，表面干燥，乳白色，不透明。菌株No.3，菌落呈圆形，直径4～6 mm，边缘菌丝状，有同心环，淡黄色，不透明。菌株No.9，菌落呈不规则形，直径3～5 mm，边缘伞边状，表面皱褶，乳白色，不透明。菌株No.18，菌落呈近圆形，直径3～4 mm，边缘菌丝状，表面粗糙，有同心环，乳白色，不透明[11]。

本研究对18株面筋腐败微生物进行革兰氏染色进行镜检结构显示，细胞单个呈现杆状，整体呈链状排列，染色结果为紫色，属于革兰氏阳性菌，芽孢呈中生、端生或偏端生，孢囊无明显膨大，能在多种不良环境中生长，每个细胞只有一个内生芽孢，属于芽孢杆菌。以菌株No.1、No.3、No.9、No.18为代表菌，革兰氏染色结果见图2，生理生化试验结果见表3。

图2 革兰氏染色镜检结果以及形态特征Fig.2 Results of Gram-stain test and characteristics of cellular morphology

由图2可知，菌株No.1，杆状，长链状，产芽孢，椭圆形，偏端生，孢囊不膨大。菌株No.3，短杆状，短链状，产芽孢，椭圆形，中生或端生，孢囊无明显膨大。菌株No.9，杆状，链状，产芽孢，椭圆形或柱形，中生或偏端生，孢囊不膨大。菌株No.18，短杆状，团状或短链状，椭圆形，芽孢中生或端生，孢囊无明显膨大。

表3 腐败菌株的生理生化结果Table 3 The physiological and biochemical characteristics of spoilage microorganisms

由表3可知，菌株No.1的氧化酶实验、吲哚实验为阴性，能利用D-葡萄糖、D-木糖和D-甘露醇，接触酶试验、V-P实验、硝酸盐还原实验、柠檬酸盐利用、丙酸盐利用、水解淀粉、水解明胶均为阳性，在30 ℃、40 ℃、50 ℃能生长，在5 ℃则不能生长，在7%、10%的高盐环境中生长良好，在pH 5.7的营养肉汤里生长良好，因此判断以菌株No.1为代表的一类为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

菌株No.3氧化酶实验、吲哚实验为阴性为阳性，能利用D-葡萄糖，不能利用D-木糖和D-甘露醇，接触酶实验、V-P实验、硝酸盐还原实验、柠檬酸盐利用、丙酸盐利用、水解淀粉、水解明胶均为阳性，在30 ℃、40 ℃能生长，而在5 ℃、50 ℃停止生长，在7%、10%的高盐环境中生长良好，在pH 5.7的营养肉汤里生长良好，因此判断以菌株No.3为代表的一类为蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）。

菌株No.9氧化酶实验、吲哚实验为阴性，能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、D-木糖，接触酶试验、硝酸盐还原实验、柠檬酸盐利用、水解淀粉、水解明胶均为阳性，丙酸盐利用为阴性，在30 ℃、40 ℃能生长，在5 ℃、50 ℃停止生长，在7%、10%的高盐环境中生长良好，在pH 5.7的营养肉汤生长良好，因此判断以菌株No.9为代表的一类为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

菌株No.18氧化酶实验、吲哚实验、V-P实验为阴性，且V-P终产物pH＞6，不能利用D-甘露醇，能利用D-木糖、D-葡萄糖，硝酸盐还原实验、柠檬酸盐反应、接触酶实验、丙酸盐利用、水解淀粉、水解明胶均为阳性，在30 ℃、40 ℃能生长，在5 ℃、50 ℃停止生长或不能生长，在7%、10%的高盐环境中生长良好，在pH 5.7的营养肉汤里生长良好，因此判断以菌株No.18为代表的一类为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）[13]。

3 结论

对面筋中腐败微生物进行分离纯化后，得到18枝菌株，经菌落形态观察，革兰氏染色等生理生化指标检测，初步鉴定该18株菌均为芽孢杆菌（Bacillus），菌株No.1、No.5、No.6、No.14、No.16、No.17为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），菌株No.2、No.3、No.4、No.7、No.8为蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides），菌株No.9、No.11、No.12、No.13、No.15为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），菌株No.10、No.18为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。

本研究选取简单的方法对面筋中的腐败微生物进行分离鉴定，进而研究其生长特性，判断面筋中腐败微生物的种类，为面筋腐败控制，防腐剂种类的选择提供依据。从现实意义上，由于面筋的制作场地大多都是作坊式的小行业，卫生条件差，且没有形成较大规模，投入成本较低[14]，无法保证使用统一的生产工艺来进行防腐，导致对于面筋的研究较少，尤其是对于研究面筋中的腐败微生物的研究更是少之又少，对面筋中腐败微生物研究可以为面筋防腐研究提供理论依据，从而更好的保障面筋制品的质量，对于小麦制品开发利用也具有意义[15]。

[1]BAILEY C H.The constituents of wheat and wheat produces[M].New York:Reinhold Publishing,1994.

[2]林作揖.食品加工与小麦品质改良[M].北京：中国农业出版社，1994.

[3]MORETTI R H.Soy milk developments in Latin America[J].J Am Oil Chem Soc,2001,58(3):521-522.

[4]东秀珠，蔡妙英.常见细菌鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[5]HARRIGAN W F.食品微生物实验室手册[M].北京：中国轻工业出版社，2004.

[6]吴佳妮.面筋的制作技术[J].农村百事通，2009（1）：19-19.

[7]中国疾病预防控制中心，营养与食品安全所.GB/T 4789.2—2010 食品卫生微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

[8]许玉慧，许喜林，辛淑敏.即食湿面条中腐败微生物的分离和鉴定的初步研究[J].中国酿造，2014，33（7）：68-71.

[9]布坎南，吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].第8 版.中国科学院微生物研究所译.北京：科学出版社，1984.

[10]徐 青，许喜林，王蔚瑜.凉茶中腐败微生物的分离纯化及初步鉴定的研究[J].食品科技，2012，37（11）：31-34.

[11]北京市疾病预防控制中心.GB 2711—2003 非发酵性豆制品及面筋卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2003.

[12]王 儒，许喜林，刘永琪，等.调味酱中腐败微生物的分离和鉴定的初步研究[J].中国酿造，2013，32（7）：43-45.

[13]黄宝莹.绿豆黄豆浆腐败微生物的分离与控制研究[D].广州：华南理工大学硕士论文，2011.

[14]王 炜.小麦面筋的特性、制取及在灌肠制品中的应用[J].中国食品添加剂，2005（5）：99-102.

[15]孙 敬，董赛男.食品中蛋白质的功能（六）食品中蛋白质的功能性质（三）——大豆蛋白和小麦蛋白[J].肉类研究，2009（9）：70-80.