湖北利川黄连HPLC指纹图谱研究

张亮　龙澜　杨永康　李亚杰　李红英　田腾飞

摘要 [目的]建立湖北利川黄连的高效液相色谱指纹图谱， 为评价其质量提供科学、有效的方法。[方法]采用C18色谱柱， 乙腈-0.05 mol/L磷酸梯度洗脱； 流速为1.0 ml/min， 检测波长354 nm；柱温为35 ℃。[结果]对湖北利川黄连10批次药材进行指纹图谱分析， 通过HPLC技术指认指纹图谱共有12个共有峰，共有峰总面积92.31%～95.67%，相似度0.940～0.986。乙腈-0.05 mol/L磷酸进行梯度洗脱最佳。[结论]该方法具有较好的稳定性和准确性，10个批次的黄连样品生成的指纹图谱可作为湖北利川黄连的标准指纹图谱。

关键词 黄连；指纹图谱；HPLC

中图分类号 S188；R284.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）19-030-02

黄连（Coptis Chinensis）属毛茛科植物，药用最早记载于《神农本草经》[1]，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，主要用于小儿惊痫、泻痢、骨蒸痨热、黄疸等症[2]。现代医学研究表明，黄连中含有小檗碱、巴马丁、黄连碱、甲基黄连碱、药根碱和及少量的有机酸等[3-4]。目前，用于黄连指纹图谱的分析方法有毛细管电泳法、红外光谱法、高效液相色谱法、核磁氢谱法等[5-8]。笔者采用高效液相色谱法，对湖北利川黄连进行分析，并制定出湖北利川黄连的指纹图谱，为黄连药材的质量评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

黄连样品来源见表1。

1.2 仪器与试剂 戴安液相3000；KQ-250D型超声波清洗器；盐酸小檗碱对照品（上海源叶生物科技有限公司），色谱乙腈，去离子水，甲醇、磷酸二氢钾、盐酸等试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件。

检测波长：354 nm，流速：1.0 ml/min，柱温：25 ℃，柱子：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。黄连指纹图谱梯度流动相见表2。

1.3.2 对照品溶液的制备。取盐酸小檗碱对照品适量，用甲醇分别配制成含盐酸小檗碱100 μg/ml的对照品溶液。

1.3.3

供试品的制备。精确称取黄连药材（粉碎过4号筛） 0.50 g，置具塞锥形瓶中，精密称定，分别精密加入甲醇∶盐酸（100∶1，V/V）30 ml，超声波提取40 min，过滤，定容于50 ml容量瓶中，摇匀，作为供试品。

1.3.4 指纹图谱的制备方法。精密吸取对照溶液和和供试品溶液各20 μl注入液相色谱仪中，按“1.3.1”的色谱条件测定。

2 结果与分析

2.1 精密度

按照“1.3.1”的色谱条件连续进同一供试品溶液5次，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果12个共有峰的保留时间RSD为0.43%～1.25%，主要色谱峰的相对峰面积RSD为0.61%～1.38%。

2.2 稳定性

取同一供试品溶液，每2 h测定一次，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果12个共有峰的保留时间和主要色谱峰的相对峰面积基本一致，RSD分别为0.52%～1.47%、0.71%～1.89%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3 重复性

取黄连药材5份，按照“1.3.3”的方法平行制备5份供试品，依法测定，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果12个共有峰的保留时间和主要色谱峰的相对峰面积基本一致，RSD分别为0.63%～1.37%，0.58%～1.61%，表明该方法的重复性较好。

2.4 黄连指纹图谱的建立

2.4.1 共有峰的确定。取表1中的10批黄连药材，按“1.3.3”的方法制备供试品溶液进样测定。盐酸小檗碱对照品和10批黄连药材指纹色谱图见图1、2。比较其色谱图，得到12个共有指纹峰，且共有指纹峰的面积占总峰面积的90%以上，以盐酸小檗碱的色谱峰为参照峰（相对保留时间α和相对峰面积RA均为1），计算色谱图中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3、4。

10个批次黄连药材相对保留时间的RSD为0.19%～0.37%，表明样品各共有峰之间的重合性好。相对保留峰面积RSD在5.79%～16.54%。每一个样品所得到的非共有峰

总面积均小于10%，符合指纹图谱研究要求的非共有峰占总峰面积百分比< 10%的规定。

2.4.2 相似度的计算。 将10批药材出峰数据导入“中药指纹图谱计算机辅助相似度计算软件”辅助自动进行峰匹配，

确定12共有峰，10批次黄连药材的相似度在0.940～0.986（表5），表明所建立指纹图谱的技术指标稳定，重现性好。

3 结论与讨论

（1）该研究对象为产于湖北利川黄连的干燥根皮，考察了不同提取剂、不同提取方法和时间的提取效果，结果以甲醇∶盐酸（100∶1，V/V），超声波提取40 min为最佳。该方法操作简单、稳定，重现性好，为研究黄连的化学成分变化、全面评价黄连药材的质量提供了一种有效的方法。

（2）该研究对黄连指纹图谱色谱条件进行了考察，在流动相的选择中，分别以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾、乙腈-0.05 mol/L磷酸、乙腈-1%甲酸、甲醇-1%甲酸等不同体积分数流动相系统进行等度和梯度洗脱试验。结果表明，乙腈-0.05 mol/L磷酸进行梯度洗脱最佳，能把大部分峰有效地分开，有利于指纹图谱的分析。

（3）通过色谱图，确认10个黄连药材有12个共有峰 ，以12号强峰作为参照峰，并计算相对保留时间和相对保留峰面积。共有峰的峰面积占总峰面积的92.31%～95.67%，符合指纹图谱研究共有峰面积大于90%的规定。

（4）研究湖北利川黄连的指纹图谱，按照该研究所提供的方法进行色谱分析，将10批次药材的色谱数据导入卫生部药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004版）软件对黄连指纹图谱进行相似度计算。结果表明，以10个批次黄连药材相对峰面积的均值作为对照模板，相似度在0.940～0.986。该方法操作简单，重现性强，专属性好，能较好地体现黄连药材成分的整体性。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中国药典2000版[M].北京：化学工业出版社，2000.

[2] 陈晓儿.综述黄连有效成分及药理作用[J].学会，2002（4）：64-68.

[3] 徐国钧，徐珞珊.常用中药材品种整理和质量研究[M].福州：福建科学技术出版社，1992：505-508.

[4] 王答棋，贺震旦，冯宝树，等.西藏胡黄连的化学成分[J].云南植物研究，1993，12（15）：831-842.

[5] 戴开金，罗奇志，罗佳波，等.黄连药材及葛根芩连方中黄连生物碱毛细管电泳分析[J].中药材，2004，27（3）：247-259.

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[8] 张铭，孙敏，樊宏伟.胡黄连药材的指纹图谱研究[J].生物学杂志，2009，26（1）：11-13.