铝毒胁迫下大豆ALMT和MATE基因的特异性表达

侯高杰 邱爱华 王茜

摘要 [目的]从转录水平揭示ALMT和MATE基因在大豆耐铝中的作用，为遗传改良获得抗性种质提供依据。[方法]对2个大豆品种进行Al处理，取胁迫后6 h（短期）、2 d（中期）和12 d（长期）的根尖提取RNA，采用qRT-PCR检测耐铝相关基因的时空表达。[结果]以MTP和UBC2为内参时，ALMT基因在铝处理2 d后的BX10中表达量与对照相比变化最大，在BD2中处理12 d后的表达量最大；当使用不同的内参校准时，MATE在同一个品种中的表达量存在差异，且在同一品种处理的3个时间点的变化趋势也不一致。[结论]不同的内参基因进行校准时，基因的表达量不同，使用2个或2个以上的内参基因进行校正能够提高结果的准确性，基因的表达变化为研究植物耐铝机制提供理论基础。

关键词 大豆；铝毒；基因表达

中图分类号 S788 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）19-034-03

大豆（Glycine max L.），是我国重要的油料作物，是食物中不可缺少的主要蛋白质来源，由于近几年作物种植模式的调整，使木薯、甘蔗等在广西的种植面积不断扩大，大豆种植面积逐渐减少。近些年广西区内自产的大豆远远不能满足自身需求，需要每年从其他地方调入大量的大豆[1]，且广西区的土壤为酸性土壤，因此，迫切需要引进优良的大豆品种来增加广西大豆的产量以满足本地消费群体的需求。铝毒被认为是在酸性土壤上限制作物生长与产量的主要因子[2]。铝对植物毒害作用最明显的特征是铝抑制了植物根尖细胞伸长和细胞分裂[3]，Delhaize等[4]研究表明，根尖积累的Al及其产生的机械损伤远远超过根其他位置。因此根尖被认为是植物受铝毒胁迫的首要作用位点[5]。植物有机酸的分泌是植物一种普遍适应铝毒的机制，并认为是一个真正抵御铝毒的机制。研究最多的有机酸类包括苹果酸与柠檬酸，已知铝诱导下植物苹果酸与柠檬酸的分泌分别是由苹果酸通道蛋（Aluminum-activated malate transporter， ALMT）和多药及毒性复合物的排出转运蛋白（multidrug and toxic compound extrusion， MATE）调控。笔者前期已经对BX10与BD2 2个品种在铝毒胁迫下有机酸种类和分泌量进行了相关研究，在此基础上，对大豆进行铝毒处理，研究相关基因的表达变化，探究大豆的耐铝机制，为培育高产、抗铝性强的品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。大豆双抗品种巴西10号（简称BX10）和对照品种本地2号（简称BD2）。

1.1.2 主要试剂。RNA提取所用试剂盒及DNaseⅠ购自上海生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScript Reverse Transcriptase及SYBR Premix Ex Taq II购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 主要仪器。J-25高速冷冻离心机（Beckman），凝胶成像系统（BioRad），DEC-810型PCR仪，定量PCR仪器（德国耶拿）。

1.2 方法

1.2.1 大豆培养。挑选相同大小的种子，使用30%的H2O2消毒约2 min，之后转入饱和的CaSO4中处理30 min，转入至沙土中培养，大豆幼苗长至7～8 cm时移栽到1/5Hoagland营养液中。铝毒处理（1/5Hoagland营养液，加入终浓度为0.5 mm/L的AlCl3）和对照（1/5Hoagland营养液，pH 4.5），用HCl调节培养液的pH，水培过程中每2 d换1次培养液，每小时通气10 min，每天8：00和18：00各调整1次pH，收集胁迫处理6 h、2 d与12 d处理与对照的根尖材料。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成。按照上海生工柱式RNA提取试剂盒说明书对材料的RNA进行提取，用DNaseⅠ对DNA进行消化，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，用Thermo Scientific NanoDrop 2000c检测总RNA浓度及纯度。用PrimeScript Reverse Transcriptase进行反转录试验。

1.2.3 实时荧光定量PCR引物设计。在NCBI上查找ALMT、MATE。用primer3.0（http：//primer3.ut.ee/）在线设计和Primer5.0软件设计，以MTP和UBC2为内参基因，前期对大豆22个内参基因进行稳定性筛选，用GeNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt值分析法分析基因的稳定性，得到MTP和UBC2为大豆在铝胁迫下表达比较稳定的基因，适合作为大豆耐铝研究的内参基因。

1.2.4 目的基因克隆与转化。对目的基因进行PCR扩增，将PCR产物进行电泳，胶回收，与载体连接，转化，之后送于华大基因测序。

1.2.5 荧光定量PCR反应。对反转录cDNA模板进行荧光定量PCR扩增，10 μl反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq （TaKaRa） 5 μl，10 μmol/L上下游引物各0.5 μl，cDNA模板0.125 μl，用ddH2O补足10 μl。反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火与延伸30 s，并收集荧光信号，45个循环，65～95 ℃生成熔解曲线，对基因表达分析时采用2-ΔΔCt法[6]对数据进行相对定量分析。

1.3 统计分析 采用 Excel 2007对荧光定量数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 ALMT基因表达 使用MTP和UBC2 2个内参基因校准ALMT基因的表达，结果见图1。以MTP为内参时，ALMT在铝处理6 h、2 d、12 d后的BX10品种中的相对表达量分别是0.44、7.58、2.68；在铝处理6 h、2 d、12 d后的BD2品种中的相对表达量分别是0.19、0.23、1.58。以UBC2为内参时，ALMT在铝处理6 h、2 d、12 d后的BX10品种中的相对表达量分别是0.65、16.34、2.38；在铝处理6 h、2 d、12 d后的BD2品种中的相对表达量分别是0.15、0.33、3.08。对比2个内参的校准结果发现，在BX10品种中，铝处理6 h后的表达量低于对照的表达量，处理2 d后表达量明显高于对照，在处理12 d后表达量降低，但仍高于对照水平；在BD2品种中基因的相对表达量在6 h、2 d后，均低于对照水平，在处理12 d后的表达量呈升高趋势。

2.2 MATE基因表达 使用MTP和UBC2 2个内参基因校准MATE基因的表达，结果见图2。以MTP为内参时，MATE基因在BX10品种和BD2品种进行铝处理6 h、2 d、12 d后的相对表达量分别是1.15、1.16、1.18和1.62、0.81、0.79；以UBC2为内参时，MATE基因在BX10品种和BD2品种进行铝处理6 h、2 d、12 d后的相对表达量分别是1.68、2.50、1.04和1.30、1.19、1.54。对比2个内参的校准结果发现，MATE基因在同一个品种3个时间点的表达变化量及变化趋势不同，以MTP为内参时，基因在BX10品种中3个时间点的表达量没有很大差异，BD2处理6 h后是对照的1.62倍，在2 d和12 d低于对照的表达量；以UBC2为内参时，基因在BX10中6 h、2 d的表达量是对照的1.68和2.50倍，高于以MTP为内参时的1.15和1.16，在12 d中的表达为对照的1.04倍，低于以MTP为内参时的1.18倍，以UBC2为内参时，MATE基因在处理6 h的BD2品种中的表达为1.30，低于以MTP为内参时的1.62，在处理2 d、12 d的BD2中的表达量是1.19和1.54，高于以MTP为内参的0.81和0.79。其结果差异是由使用不同内参基因校准时引起的，同时也说明稳定性的内参基因对于试验结果的促进作用，采用多个内参基因进行分析可以使结果更加可靠。

3 结论与讨论

ALMT基因编码的是位于细胞膜上的苹果酸转运蛋白基因，该苹果酸转运蛋白的功能是将苹果酸从细胞膜内转运至膜外，通过苹果酸与铝在细胞膜外的络合作用，形成无毒的络合物，降低铝的毒害作用。Ligaba等[7]根据拟南芥AtALMT1基因序列设计简并引物克隆了油菜中编码铝诱导的苹果酸通道蛋白基因BnALMT1和BnALMT2，将油菜的2个基因在蟾蜍卵母细胞和烟草细胞中过量表达，结果表明，这2个基因均参与铝诱导的苹果酸分泌，从而提高油菜抗铝毒能力[8]。该试验结果显示，ALMT基因在BX10品种处理2 d后的表达量升高，推测该基因可能参与了植物的耐铝机制，而该基因在BD2品种处理12 d后缓慢增加，在BD2中也可能有该基因参与植物的耐铝机制，可能由于BX10品种是双抗品种，耐铝性比BD2品种好，会使ALMT基因在2个大豆品种中的表达在时间和量上存在差异。

MATE是一个新的转运蛋白家族，广泛存在于微生物、植物和哺乳动物细胞内，Magalhaes等[9]从高粱中分离鉴定了一个耐Al基因sbMATE，Al胁迫下，sbMATE的表达量与柠檬酸的分泌速率呈正相关。过量表达sbMATE的转基因拟南芥耐Al性与对照相比明显增强，Eticha等[10]通过构建菜豆的SSH文库发现，与大豆根尖细胞的铝诱导柠檬酸分泌相关的MATE基因在铝胁迫下上调表达。该试验中MATE基因在测定的时期没有明显的表达变化，可能是由于该试验的取样时期较少，还不能够完全地表现出MATE基因不同时期的表达变化。

参考文献

[1] 罗培敏，黄拔程，沈莹.广西大豆生产的发展与思考[J].大豆科技，2010（5）：41-43.

[2] 李刚，徐芳杰，张奇春，等.铝对小麦根尖细胞壁过氧化物酶活性和过氧化氢含量的影响[J].浙江大学学报，2009，35（6）：619-625.

[3] 孔繁翔，桑伟莲，蒋新，等.铝对植物毒害及植物抗铝作用机理[J].生态学报，2000，20（5）：855-862.

[4] DELHAIZE E，RYAN P R.Aluminum toxicity and tolerance in plants[J].Plant Physio1，1995，107：315-321.

[5] 俞慧娜，刘鹏，徐根娣，等.铝胁迫下大豆根尖细胞铝的微区分布与耐铝性分析[J].作物学报，2009，35（4）：695-703.

[6] LIVAK K J，SCHMITTGENT D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method[J].Methods，2001，25：402-408.

[7] LIGABA A，KATSUHARA M，RYAN P R，et al.The BnALMT1 and BnALMT2 genes from rape encode aluminum-activated malate transporters that enhance the aluminum resistance of plant cells[J].Plant Physiology，2006，142（3）：1294-1303.

[8] LIGABA A，KATSUHARA M，SAKAMOTO W，et a1.The BnALMT1 protein that is an aluminum-activated malate transporter is localized in the plasma membrane [J].Plant Signaling & Behavior，2007，2（4）：255-257.

[9] MAGALHAES J V，LIU J，GUIMARES C T，et al.A gene in the multidrug and toxic compound extrusion （MATE） family confers aluminum tolerance in sorghum[J].Nature Genetics，2007，39（9）：1156-1161.

[10] ETICHA D，ZAHN M，BREMER M.Transcriptomic analysis reveals differential gene expression in response to aluminium in common bean （Phaseolus vulgaris） genotypes[J].Annals of Botany，2010，105（7）：1119-1128.