新X 连锁缺失突变致Alport 综合征的研究

高春林，夏正坤，樊忠民，高远赋

0 引 言

Alport 综合征(Alport Syndrome，AS)是一种进行性的遗传性肾小球疾病，表现为镜下血尿或肉眼血尿，可伴有蛋白尿，听力及视觉异常，可进展至终末期肾病［1-2］，是危及儿童及青少年生命健康的重要疾病之一［3］。随着医学的发展及诊疗水平的提高，其发病率呈上升趋势。据2008 年北美儿童肾脏实验及合作性研究中心的数据显示，Alport 综合征患儿肾移植占同期儿童期肾移植的2.3%，占儿童期血液透析的1.9%，其发病率为1 ∶5000 活产儿［4］。其病因为编码Ⅳ型胶原α3、α4、α5 链的基因突变所致，其中α3、α4 基因突变所致为常染色体显性或隐性遗传，α5 链基因突变所致为X 染色体连锁的显性遗传［5-7］。迄今为止已有近700 个基因突变被发现［8］。大部分的突变所致Ⅳ型胶原α3、α4、α5链的异常可通过免疫荧光检测皮肤或肾组织相应链的异常而诊断，但少数突变免疫荧光方法显示Ⅳ型胶原α3、α4、α5 链无缺失而导致无法确诊。本研究利用高通量第2 代测序技术对一中国汉族家系进行研究，结果发现一新的α5 链缺失突变，为国内外首次报道。

1 资料与方法

1.1 临床资料 先证者，男，4 岁3 个月，因肉眼血尿15 个月就诊。患者于呼吸道感染后出现肉眼血尿，表现为全程肉眼血尿，浓茶色，不伴有尿频尿急尿痛，无呕吐腹痛，无头痛，无少尿。查血尿为多形型血尿，尿沉渣计数在3000 ～7000 万/mL，抗炎治疗无效。查体:心率88 次/min，呼吸23 次/min，血压96/68 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，神志清楚，精神反应好，全身未见浮肿，无皮疹，心肺腹部查体无异常。神经系统体征阴性。听力及眼底无异常。父母非近亲结婚，家族中有类似病史。入院后结果:血常规三系在正常范围，肝肾功能及血脂电解质正常，自身抗体及补体正常，乙型肝炎病毒病原学检测及传染病4 项结果正常。双肾大小在正常范围，无肾结石及左肾静脉受压，心电图及X 线胸片正常。尿蛋白(+)，尿红细胞满视野，尿沉渣计数在5000 ～7000 万/mL，多形型。见表1。

家系调查:家族3 代，共计7 例患者，男4 例，女3 例，其中男性患者表现重，除了明显肉眼血尿外，先证者舅舅已行肾移植，先证者及其胞弟、表兄表现为肉眼血尿。3 例女性患者，先证者外祖母以血液净化维持生命。先证者外祖父及外祖母均未患病，亦非近亲结婚。见表1，图1。

表1 患者家系血(尿)液电解质及临床资料特点Table 1 Clinical data of the 7 patients

图1 患者家系图Figure 1 Pedigree diagram of the Chinese family with Alport syndrome

1.2 病理研究方法 采用B 超引导下经皮负压式肾活检术，活检肾组织按常规方法进行光免疫荧光和电镜检查。

1.3 DNA 测序研究方法

1.3.1 基因组DNA 提取 抽取受检者的外周血约3 mL。用 QIAamp 外 周 血 DNA 提 取 试 剂 盒(QIAamp，德国)，按其指南提取基因组DNA。本研究征得本院伦理委员会批准，患者家属同意并签署知情同意书。

1.3.2 COL4A3/COL4A5/COL4A4 基因序列获取 从数据库NCBI 获取人类COL4A3/COL4A5/COL4A4 基因DNA 序列。

1.3.3 DNA 测序 ①外显子测序 用BGI 的定制芯片NimbleGen Sequence Capture Arrays 结合Illumina Hiseq 2000 的高通量测序技术，根据Illumina/Solexa标准建库说明书，将基因组DNA 随机打断成200 ～300 bp 的片段，随后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库，文库经纯化后经过ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与捕获试剂进行杂交富集，再经过LM-PCR 的线性扩增后进行上机测序。测序平台为Illumina Hiseq 2000，读取长度为90 bp，每个样本的平均测序深度最少为150×。测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software 1.7 进行处理，经过过滤去污染、使用SOAPaligner 2.20 比对参考基因组，获得比对到基因组上的Unique mapped reads。靶区域的基因型由SOAPsnp 确定。对结果通过dbSNP 数据库，HapMap 数据库，千人基因组数据库等公共数据库的过滤，最终只保留编码区上的非同义突变。②sanger 测序验证 分别对3名患者、4 名家系内未发病成员进行检测，针对COL4A5 基 因c.1365_1373delTCCAGGCCC 突 变设计引物，通过PCR 扩增，产物纯化，利用Primer Premier 5 软件自行设计能够扩增COL4A5 基因21号外显子编码区及剪切位点的引物，并由英捷(上海)贸易有限公司合成。COL4A5 引物序列为:F:CATTCCTGGACCTCCTGGACTTGA R:CATTCCTGGACCTCCTGGACTTGA。PCR 条件为:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s;60 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s，共35 个循环，最后72 ℃延伸10 min，15 ℃保存。PCR 产物测序:用Big Dye Terminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems 美国)按厂商的步骤进行。

1.3.4 测序结果分析方法 测序结果用Mutation Surveyor V4.0.5(demo)软件(美国Softgenetics 公司)分析，所得序列与NCBI 数据库中的COL4A3/COL4A5/COL4A4 基因序列进行比对。碱基变异参考人类基因组变异研究学会制定的序列变异命名的命名法则，以GenBank cDNA 序列的翻译起始密码子ATG 中的A 为+1 位核苷酸进行命名。物种间保守性分析采用在线分析软件［9］。

2 结 果

2.1 光镜结果 肾病理:22 个小球，未见硬化，肾小球体积稍大，细胞数增多，100 ～120 个/小球系膜细胞4 ～6/hp，系膜基质轻-中度增宽，毛细血管袢开放可，基底膜无增厚，部分小球轻微球囊粘联，Masson 染色阴性，小管间质病变轻，小灶性小管萎缩，间质区无明显异常，IgM+。

2.2 电镜结果 先证者肾组织表现为少量足突融合，上皮下可见电子致密物沉积，而基膜无明显变薄，无分裂。缺乏AS 的典型表现。

2.3 Ⅳ型胶原免疫荧光检测 免疫荧光检测结果发现，无论是皮肤α5 链还是肾组织的α3、α5 链均表现为正常，无缺损表现。不符合典型AS 的表现。

2.4 测序结果 对先证者测序发现COL4A5(NM_000495)上的存在1 个可疑突变即c.1365_1373 delTCCAGGCCC(p.Pro456_Pro458del3)，即在此基因上缺失1365_1373 处的碱基，见图2，导致此基因编码的蛋白在456 ～458 位发生缺失，较之野生型蛋白的1685 个AA，突变型蛋白仅有1682 个Aa。此突变没有相关报道，为已知基因新突变。

Sanger 测序进行验证结果表明，发现所有未受累的男性家族成员均不带有该突变，女性带有杂合突变，3 个男性患者均带有纯合c.1365_1373delTCCAGGCCC(p.Pro456_Pro458del3)突变，结合此疾病具有外显率的情况，在家系内证明基因型与表型存在共分离，证明该突变为该家系的致病性突变。结合家系图谱及患者情况，以及此类疾病X 连锁存在女性外显率不全的情况，符合X 连锁遗传模式。

利用生物信息学分析发现，由于这9 个碱基的缺失，导致456-458 位的3 个氨基酸(PGP)缺失，该缺失正好位于2 个G-X-Y 中间(CEPGPPGPPGSPGDKGLQGEQGVKGDKGDT)，形成缺失了1 个GX-Y(GPP)的序列，该缺失序列在各物种间高度保守，见表2。

图2 COL4A5 基因的部分测序结果Figure 2 Part of the COL4A5 gene sequencing results for the index case and his family members

表2 各物种间序列(TCCAGGCCC)的保守性分析Table 2 Conservative analysis of the sequence(TCCAGGCCC)among different species

3 讨 论

AS 最早于1927 年被首次报道［10］，随着医疗技术水平的整体提高，儿童AS 的诊断率也日渐提高，是目前导致儿童终末期肾病的重要疾病之一。由于其属于遗传性疾病，进展致终末期肾病的过程无法逆转，治疗方法有限，因此该病对患儿健康危害极大，而引起儿科医生的高度关注。

从该家系的临床表现看，符合X 连锁显性遗传规律，本研究根据其阳性家族史血尿表现，尽管缺乏肾外受累表型，但仍高度怀疑AS。由此，本研究期望通过肾脏病理及Ⅳ型胶原的检测，来明确诊断。但是先证者及胞弟的肾脏病理缺乏典型的基底膜表现，Ⅳ型胶原染色提示无异常。Becknell 等［11］曾报道12 号外显子c.665(T665G)突变导致Ⅳ型胶原染色正常但致典型AS 表型。为进一步验证是否也存在本研究未发现的位点突变，并进行了基因诊断。

二代测序是目前公认的高通量高效的检测手段［12］，本研究利用外显子测序法结合sanger 法验证，结果发现COL4A5 基因存在c.1365_1373del TCCAGGCCC 9 个碱基的缺失，导致21 号外显子翻译异常，通过生物信息学分析，发现缺失的456 ～458位的3 个氨基酸PGP 正好位于2 个G-X-Y 中间(CEPGPPGPPGSPGDK)，使得GPPGPPGSP 序列变为GPPGSP，即缺失了一个G-X-Y(GPP)的序列。进一步生物信息学分析发现，该位点在各物种间高度保守，说明其功能是至关重要的。已知Ⅳ型胶原是由α1-α6 6 条 肽 链 组 成 的 三 聚 体，α1α1α2，α3α4α5，和α5α5α6。其中COL4A5 和COL4A6 位于X 染色体，所有的基因编码50 个外显子，近1600个氨基酸，组成N 端7S 基序，C 端非胶原基序，中间为大的胶原基序，间插有22-26 个重复的Gly-X-Y序列。X 为脯氨酸或赖氨酸，Y 为羟脯氨酸或羟赖氨酸，这种特有的结构参与形成了基底膜网络［5，13-14］。当COL4A5 基因突变时，由于缺乏正常结构的α5 链，肾小球基膜α3α4α5 异三聚体组装异常，α2α1α2 链代偿增多［15］。增多的α2α1α2 链组成的胶原网络稳定性和柔韧性差，电镜下表现为基膜厚薄不一，花篮状改变，基膜致密层的断裂分层。针对Ⅳ型胶原NC1 区的免疫荧光染色可表现为免疫荧光染色完全或部分缺失。本家系中电镜及免疫荧光表现不符合常见Alport 综合征的表现，提示其可能存在不同常见位点突变所致的病理表现。进一步基因测序研究证实为新的缺失突变。结合皮肤四型胶原ELSIA 法研究，未发现基底膜α5 链异常表达，说明该缺失不影响NC1 区蛋白表位，但却极大影响了基膜网络的功能。

根据欧洲、美国，德国及中国等5 个研究中心的研究数据［16-17］，Gross 等将COL4A5 基因突变位点与临床表现严重程度分为3 类:严重型(S 型)、中度-重度严重型(M-S 型)、中度型(M 型)。S 型青少年期起病，年龄在20 岁以下，80%伴有听力异常，40%伴有视觉异常，是由于大片段重组或提前终止翻译或者移框突变或N 端序列突变等。M-S 型在26 岁前进展至终末期肾病，肾外受累较少，主要基因异常在21-47 号外显子区发生非甘氨酸错义突变，甘氨酸替代突变，框内或受体剪切位点突变等。M 型则在1-20 号外显子，30 岁以后出现终末期肾病，70%的人有听力丧失，最多30%眼睛受累，Bekheirnia 等［18］的研究也得到一致的结果，大部分进行性进展的AS 是由于截断突变、大或小缺失突变、或剪切突变所致。结合本家系，缺失位于21 号外显子，肾外受累较少，表型为中等到严重程度(M-S)，与该分型描述一致，也说明本研究结果准确，但突变方式为缺失，为首次报道已知基因新位点的突变。

根据Flinter 的AS 的诊断标准［19］:①血尿/或慢性肾衰家族史;②电镜下基底膜特征性改变;③眼前锥晶体或视网膜黄斑点状改变;④进行性耳感音神经性耳聋，4 项中符合3 项即可临床诊断。国内目前认为确诊的方法［20］:①电镜下典型病理改变;②皮肤基膜α5 链表达异常;③COL4A5/3/4 基因突变。根据本家系资料，认为基因突变检测是确诊该疾病的最重要的最终手段，因为电镜结果或者基底膜α3、α5 链表达，是比较间接的结果，有可能引起漏诊。结合Gross 等的分型与表型关系结果，M-S型肾外受累较少，或年幼儿听力检查存在局限性，Flinter 的标准易导致临床无法诊断。儿童肾科医师需要提高认识，必要时借助于基因检测方法来确诊，并有助于指导优生优育。

总之，本研究利用基因测序法对一AS 家系进行研究，发现了新的COL4A5 基因1365_1373delTCCAGGCCC(p.Pro456_Pro458del3)胶原区缺失突变，截至2015 年4月为国内外首次报道。临床上可以用于AS 综合征病变的检测，疾病的分子诊断及产前诊断，丰富了目前COL4A5 的突变信息，为在此家系中开展疾病监测起到重要作用。

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