结核感染T细胞斑点试验对尘肺结核的诊断价值

李林阳，廖江荣

结核感染T细胞斑点试验对尘肺结核的诊断价值

李林阳，廖江荣

尘肺；结核

尘肺是由于在职业活动中长期吸入生产性粉尘并在肺内潴留而引起的以肺组织弥漫性纤维化为主的全身性疾病，是我国现阶段最主要、最严重的职业病病种[1-2]。肺结核是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，是尘肺常见的严重合并症。临床上把这两种病变复合共存的特殊类型单列为尘肺结核[3]。尘肺结核患者体内的矽尘与结核菌协同作用引起复杂的组织反应，使其病理改变、临床表现与影像学特点均不同于单纯的尘肺或结核[4]。尘肺结核在临床上常被漏诊或误诊。传统的结核病辅助诊断方法如痰涂片抗酸染色(AFB)、结核菌素试验(TST)、结核抗体检测等均存在敏感性或特异性方面的不足，而“结核分枝杆菌培养”作为诊断结核的金标准，特异性虽高但敏感性低，且培养时间一般为2～8周。结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)为近年来发展起来的一种诊断结核性疾病的新方法[5]。本研究将T-SPOT.TB与PPD试验、TB-Ab检测、痰AFB等方法进行比较，探讨其在尘肺结核诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入2014年4月－2015年2月入住我院呼吸科、临床诊断疑似尘肺结核(SCTB)的患者为研究对象。所有患者均进行详细病史采集，并平行进行T-SPOT.TB、TB-Ab、AFB、TST等检测。

1.2 诊断标准 根据临床症状、实验室检查结果及随访后最终诊断，将疑似病例分为尘肺结核组与尘肺组。尘肺诊断标准：依据中华人民共和国卫生部尘肺病诊断标准(GBZ70-2009)，由专门的尘肺病诊断专家小组进行确诊，并发放尘肺病鉴定证书。尘肺结核的诊断标准：(1)临床诊断：①有结核接触病史，近期出现低热、盗汗、乏力、消瘦等结核中毒表现；②合并有结核性胸膜炎；③高千伏X线提示：肺尖或锁骨下出现不对称小片状或斑片状密度不均阴影，或上肺野迅速出现浸润病灶；动态胸片可见原已确诊为尘肺的融合团块短期多变，形成形态不规则的较大空洞，伴同侧或对侧播散者病变进展快，毁损、破坏等改变严重；④常规抗感染治疗2周无效，经抗结核治疗后好转，跟踪随访半年，胸片提示病灶明显吸收，最终确诊；(2)实验室检查：痰、支气管镜刷片、灌洗液结核分枝杆菌涂片阳性，病理检查可见结核典型改变(如干酪样坏死)。患者HIV抗体均呈阴性，近期无严重病毒感染史，无严重肝肾衰竭，近期无输血及PET-CT检测，无免疫抑制剂用药史及放化疗治疗。

1.3 实验室检测项目

1.3.1 AFB检测及结果判定 按照说明书进行。

1.3.2 PPD试验 所有入选患者左前臂曲侧中上部1/3处皮下注射5U(0.1ml)人型纯蛋白衍生物(purified prote in derivatives，PPD)试剂，实验后48～72h观察并记录结果，硬结直径≥5mm判定为阳性。

1.3.3 结核抗体检测 按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 T-SPOT.TB检测 (1)操作步骤：①采集肝素锂抗凝的外周血5ml行外周血单个核细胞(PBMC)分离，采用全血模式进行细胞计数，配制成终浓度为25万个单个核细胞/100µl的细胞悬液。②在每个样本的板条上按顺序设置阴性对照、抗原A(早期分泌性靶抗原6，ESAT-6)、抗原B(滤液培养蛋白10，CFP-10)、阳性对照，再按上述顺序，在4个孔中分别加入已制备好的终浓度细胞悬液100µl，将培养板放入37℃、5%CO2浓度培养箱中培养16～20h，PBS洗4次。③每孔加入50µl新鲜配制的酶标二抗工作液，2～8℃孵育1h，PBS洗4次。④每孔加入50µl显色液，避光显色7～12min，蒸馏水终止显色3～4次，使用滤纸拍板，自然干燥后进行结果判读，干燥后的板条可在干燥避光条件下长期保存。(2)结果判读：①阴性对照孔斑点数为0～5个，且(抗原A孔或抗原B孔斑点数)－(阴性对照孔斑点数)≥6，为“阳性”；②阴性对照孔斑点数为6～10个，且(抗原A孔或抗原B孔斑点数)≥2×(阴性对照孔斑点数)，为“阳性”；③如不符合上述标准，且阳性对照孔正常时检测结果为“阴性”。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计分析，计算灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比、Youden指数等，使用U检验比较不同检测方法灵敏度、特异度等诊断效果评价指标的差异性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

共纳入疑似尘肺结核患者94例，其中男66例，女28例，年龄21～79(48.6)岁。尘肺结核65例，男43例，女22例，年龄26～79(50.2)岁。支气管肺泡灌洗液检出抗酸杆菌者8例，支气管刷检检出抗酸杆菌者6例，痰涂片发现抗酸杆菌者4例，经皮肺活检组织病理证实为结核病者5例，抗结核治疗后临床症状明显改善且胸片显示病灶明显吸收者42例。尘肺29例，男23例，女6例，年龄21～73(48.9)岁，均符合SC诊断标准，经抗感染治疗后胸片提示病灶吸收。

4种检测方法对肺结核的单项检测结果见表1，诊断效果见表2。T-SPOT.TB检测肺结核的灵敏度显著高于TB-Ab、PPD试验和AFB(u=4.925，P<0.001；u=6.156，P<0.001；u=11.637，P<0.001)。T-SPOT.TB检测肺结核的特异度显著高于PPD试验(u=2.169，P<0.05)，T-SPOT.TB的特异度与TB-Ab、AFB比较差异无统计学意义(u=1.867，P>0.05；u=1.466，P>0.05)。T-SPOT.TB检测肺结核的Youden指数显著高于TB-Ab、PPD 和AFB(u=4.306，P<0.001；u=5.130，P<0.001；u=8.218，P<0.001)。T-SPOT.TB对肺结核的检出效果明显优于TB-Ab、PPD试验和AFB。

表1 4种检测方法结果比较Tab.1 Comparison of the results of 4 test methods

表2 4种检测方法诊断效果比较Tab.2 Comparison of the diagnostic effects of 4 test methods

3 讨 论

尘肺患者肺内沉积着大量难溶性矽尘，使肺部毛细血管床和淋巴系统严重受损，肺纤维化破坏了大批巨噬细胞，削弱了巨噬细胞吞噬、消化、杀菌的能力。同时结核免疫的效应细胞也受到影响，使入侵的结核菌不能被及时消灭而继续繁殖、生长、播散，阻碍了结核获得性免疫的建立，因此尘肺患者易于合并肺结核。已知尘肺结核可促进尘肺病发展，尘肺又可促进结核病病情恶化，使尘肺结核的死亡发生率显著增高[6]。因此，尽早确诊尘肺结核对降低患者病死率、延长尘肺患者生命具有重要意义。

PPD是从结核分枝杆菌中粗提的抗原混合物，含有超过200种抗原成分，其中很多是非结核分枝杆菌及卡介苗(bacillus calmette-gurin，BCG)的共同抗原成分，易发生交叉反应，造成较高“假阳性”率。其次，TST对于感染结核菌2周之内、近期免疫受抑制者、重症患者、年幼儿童及营养不良、器官移植者缺乏足够灵敏度。本研究PPD试验敏感性为58.5%，特异性为72.4%。Meta分析指出PPD试验的诊断敏感性为78.7%～81.6%，特异性为52.4%～57.9%[7]。与本研究数据差异较大，主要可能是尘肺患者免疫功能低、全身反应弱所致。本研究T-SPOT.TB敏感性为96.9%，特异性为93.1%，与Cho等[8]及高爱忠等[9-11]的研究结果相近。Piana等[12]认为T-SPOT.TB在免疫抑制患者中有稳定的灵敏度和性能。本研究中T-SPOT.TB假阴性率仅为3.08%，而PPD试验假阴性率41.54%，也说明T-SPOT.TB检测稳定性好，准确率高，受免疫功能影响小。

血清TB-Ab是由机体感染结核杆菌后针对结核菌素混合抗原所产生的一组免疫球蛋白。一项Meta分析显示，抗结核抗体检查具有较大的不稳定性，各种测试之间差异较大[13]。储新民等[14]报道TB-Ab对结核类疾病诊断的敏感性和特异性都远低于T-SPOT.TB等其他结核检测方法。本研究中结核抗体敏感性66.2%，特异性75.9%，均低于本研究中T-SPOT.TB的敏感性(96.9%)及特异性(93.1%)。

尽管痰涂片抗酸染色简便、快捷，特异性高，但敏感性较低。大量资料显示，当痰液中分枝杆菌含量为(1000～10 000)/ml时，其痰涂片阳性率为40%～50%，表明大量涂阴结核患者未检出，漏诊率较高。本研究中抗酸杆菌试验敏感性为27.7%，与敏感性为93.1%的T-SPOT.TB比较不具优势。

T-SPOT.TB结合了酶联免疫斑点技术(即ELISPOT技术)与γ-干扰素释放试验，通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染。结核感染后体内长期存在抗原特异性T细胞，当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增殖，释放γ-干扰素。本实验利用ESAT6和CFP10两种结核特异性抗原刺激外周血中结核特异性T淋巴细胞分泌γ-干扰素，通过ELISPOT方法检测γ-干扰素的释放水平(即斑点多少)，从而判断机体是否感染结核杆菌。ESAT6和CFP10均来自结核分枝杆菌基因组RD1区域，且仅结核分枝杆菌复合群存在RD1区，因此，该检测不受卡介苗接种、环境分枝杆菌感染的影响，特异性强，是目前早期发现结核病最有效的检测手段。本研究中T-SPOT.TB敏感性96.92%，特异性93.10%，与文献报告相近[8-11]，高于PPD试验、AFP及TB-Ab检测。Meier等[15]认为血T-SPOT.TB高阴性预测值对于排除结核病有重要价值。有文献报告免疫抑制状态也不影响T-SPOT.TB敏感性，适用于免疫低下、接受免疫抑制剂治疗患者结核感染的检测[16]。本研究T-SPOT.TB假阳性率为6.9%，低于PPD试验(27.6%)和TB-Ab(24.1%)，尽管AFP假阳性率为0，但敏感性远低于T-SPOT.TB。T-SPOT.TB假阴性率3.1%，低于PPD试验(41.5%)、结核抗体检测(33.8%)和AFP(72.3%)。

综上所述，T-SPOT.TB对诊断尘肺结核显示出较好的敏感性、特异性，且假阳性率、假阴性率较低，有临床诊断价值。但T-SPOT.TB检测尚不能完全鉴别诊断潜伏性结核感染与活动性结核感染，这在结核发病率高，潜伏性结核多的我国，削弱了T-SPOT.TB诊断活动性结核感染的特异性。尽管如此，T-SPOT.TB还是展现了较好的应用前景。

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R598

A

0577-7402(2015)08-0683-03

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.08.17

2015-03-14；

2014-06-29)

(责任编辑：沈宁)

遵义市科技局资助项目(201329)

563000 贵州遵义 贵州航天医院肺科(李林阳、廖江荣)

廖江荣，E-mail: ljr3409@sina.com