葛根素对α-葡萄糖苷酶抑制作用机理的探讨

徐婷,褚江洪,丁萍英,倪连松

(温州医科大学附属台州医院 内分泌科，浙江 临海 317000)



葛根素对α-葡萄糖苷酶抑制作用机理的探讨

徐婷,褚江洪,丁萍英,倪连松Δ

(温州医科大学附属台州医院 内分泌科，浙江 临海 317000)

目的 探讨葛根素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用机理。方法 取40只雄性小鼠，分为5组：对照组、阿卡波糖对照组、葛根素(2.5、5.0、10)μM，每组8只，采用酶抑制动力学方法，研究葛根素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制动力学，并用分光光度计测定葛根素对小鼠血糖含量变化的影响。结果 葛根素是一种可逆的竞争型α-葡萄糖苷酶抑制剂 [半抑制浓度IC50为(4.32±0.42)μM]，抑制常数Ki为(0.41± 0.09)μM；与阳性对照阿卡波糖对比，葛根素能够明显的抑制大鼠血糖水平的增长。结论 葛根素作为一个α-葡萄糖苷酶抑制剂，诱导了酶活性的降低，对调节血糖水平起到重要作用，为临床降血糖提供了理论基础。

葛根素；α-葡萄糖苷酶；抑制作用；血糖水平；糖尿病

糖尿病类型主要有两种：1型糖尿病和2型糖尿病，它们所引起症状几乎是相同的[1]，但是所引起疾病的病理却是有所差别的[2]。α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)种类繁多，性质各异，广泛的分布在生物体内，它可以从低聚糖类的非还原末端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖[3]，在人类的正常糖类代谢和机体功能方面起到了重要的生理作用，但是当人体内血糖过高时，可以通过抑制α-glucosidase的活性来降低血糖的含量[4]，起到治疗糖尿病及其并发症的效果，因此，在医药行业中α-glucosidase抑制剂被广泛用于预防和治疗糖尿病、高血脂等疾病；

葛根素(puerarin)亦称葛根黄素，是从中药葛根中分离的具有扩冠作用的异黄酮类衍生物，存在于豆科植物葛及野葛的根，具有退热、镇静和使冠状动脉血流量增加的作用。有大量文献表明，葛根素具有降低血糖的作用，但其作用机制以及活性组分的详情尚不清楚。本课题葛根素为抑制剂，通过体外酶抑制实验并系统深入研究了其对α-glucosidase的相关抑制动力学，并通过对灌胃的小鼠血糖值的抑制作用研究，最终获取葛根素对α-glucosidase的抑制机理，以期为其在降血糖医药领域的更有效应用提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 将禁食16 h的雄性小鼠40只(上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号:SGXK(沪)2013-0010)，分为5组，每组8只，(第一组为对照组，第二组为阿卡波糖对照组，第3组～第5组为葛根素的3个浓度组)。

1.2 仪器与试剂 UV-2450紫外、可见分光光度计(日本岛津公司)；pHs-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)；Millipore Simplicity水纯化系统(法国密理博公司)；血糖测定试剂盒(兰州生物化学试剂公司)。

α-葡萄糖苷酶从面包酵母中得到(上海TCI公司)，其标准溶液用pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液进行配制；对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、阿卡波糖(Sigma公司)标准储备溶液用pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液进行配制；葛根素(阿拉丁试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.3 实验方法

1.3.1 葛根素对α-glucosidase的抑制作用：α-glucosidase活性的测定参考Ohta[5]的方法，α-glucosidase催化pNPG产生对硝基苯酚(在处有特征吸收峰)，因此本研究利用UV-2450紫外分光光度计的动力学/时间软件测定在405 nm处的紫外吸收(酶催化pNPG生成对硝基苯酚)，在37 ℃下，pH 7.0的磷酸盐(0.5 mM)缓冲体系中，α-glucosidase(1.0 μM)和不同浓度的葛根素孵化3 h，加pNPG(0.5 mM)后，每隔30 s在405 nm处测定吸光值的变化，并通过下列关系式对α-glucosidase活性进行评估活性抑制测定重复3次。抑制率(%)=[ΔAbs540(空白)-ΔAbs540(样品)/ΔAbs540(空白)]×100%。

1.3.2 葛根素对α-glucosidase的抑制动力学研究：在上述实验条件下，固定α-glucosidase的浓度，测定不同葛根素浓度条件下，底物浓度对α-glucosidase催化速率的影响，根据Lineweaver Burk双倒数图，计算并评估葛根素对α-glucosidase的抑制作用类型，最终求出抑制常数Ki抑制动力学实验重复3次。

1.3.3 葛根素对小鼠血糖含量的影响：对照组：用灌胃器吸取0.1～0.2 mL suerose (2 g/kg)溶液灌入第一组小鼠的胃中，15 min后再灌入同样体积的双重蒸馏水，之后从灌入双重蒸馏水以后开始计时，分别在30，60，120 min时以断尾取血的方法对小鼠的血糖值进行测定。第2组～第5组将对照组中的双重蒸馏水分别替换为阿卡波糖(10 μM)，葛根素(2.5, 5.0, 10 μM)，其他组份不变。测定血糖时，将每组每只小鼠不同的时间点都需进行编号，并将血液收集在离心管中，然后进行离心3000 r/min，时间为15～20 min左右，最后收集管中上层的血清，用分光光度计进行比色测定血糖含量测定重复3次。

2 结果

2.1 葛根素对α-glucosidase的抑制活性 图1为葛根素的分子结构式。图2显示，随着葛根素浓度的增加(0～20 μM)，抑制率在不断升高，随着葛根素的浓度达继续增加，对α-glucosidase的抑制能力的趋于平缓，解析其半数抑制浓度(IC50)为(4.32±0.42)μM，与阳性对照阿卡波糖(IC50)为(18.12±1.15)μM相比，葛根素对α-glucosidase的半抑制浓度低于阳性对照阿卡波糖，表现出了良好的α-glucosidase抑制活性。

图1 葛根素的分子结构式Fig.1 Structure of puerarin

图2 葛根素抑制α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of puerarin on α-glucosidase

2.2 葛根素对α-glucosidase抑制动力学研究 通过Lineweaver-Burk双倒数方程作图，求得和比较酶催化反应的动力学参数表观米氏常数(Kmapp)和最大反应速率(Vmax)，Lineweaver-Burk双倒数图 (图3)是相交于纵坐标的一组直线，这表明体系中Vmax保持不变，而Kmapp逐渐增大，这是典型的竞争性抑制作用类型[6]。这表明葛根素可能会结合到α-glucosidase的活性中心区域并与周围的氨基酸残基发生相互作用，一方面会与底物竞争活性位点，另一面会诱导酶的结构发生变化是酶自身的催化活性降低。在此基础上，通过二级曲线方程，求得抑制常数Ki=(0.41± 0.09)μM。

图3 葛根素抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲线Fig.3 Lineweaver-Burk plot for inhibition of puerarin on α-glucosidasec(葛根素)/(μM), 从下向上：0, 2.5, 5.0, 10.(n=3).

图4 葛根素对血糖水平增长的抑制作用Fig.4 The inhibition of puerarin on the increase of blood glucose levels

2.3 葛根素对小鼠血糖含量的影响 结果显示，用蔗糖灌胃后的小鼠再用葛根素灌胃，由图4可以看出，葛根素对抑制血糖值的升高方面有显著的剂量依赖性，在对照组中，当加入蔗糖后，血糖值由74.66 mg/dL升高到179.54 mg/dL，而随后又降了下来，在葛根素和阳性对照这四组中，在给药后30 min，小鼠的血糖值与对照组相比都出现了明显的降低，葛根素(5 μM)与阿卡波糖(10 μM)表现出了相当抑制作用。

3 讨论

体内胰岛素分泌不足所导致的一系列临床综合症称之为糖尿病，这是一种与遗传基因有着非常密切的疾病。多饮、多尿、多食和体重下降(三多一少)为糖尿病的主要临床表现，此外其病理检测手段主要是依据血糖高、尿液中含有葡萄糖等现象，而糖尿病所引起的并发症[7-9]给人们的生理和心理上都造成了巨大的伤害，故安全，有效的降血糖药物的开发越来越受到专家和学者的重视。糖尿病的的主要类型分为:1型和2型两种，1型糖尿病始于体内胰腺中胰岛β-细胞产生了应激反应，黄酮类物质能改善这类糖尿病的病症，此外，黄酮类物质还能通过许多途径激发出弱的胰岛素效应，比如影响磷酸蛋白激酶，α-glucosidase来降低血糖的活性。本研究可以初步推测：在降血糖方面，黄酮发挥了主要作用，在8种黄酮中，7种黄酮具有α-glucosidase抑制活性。

目前，Acarbose是常用于临床辅助治疗的α-glucosidase抑制剂，但是它会对人体产生很强的毒副作用[1]，故不能被全部人群所接受，而新的化学合成药物需要的步骤较繁琐、毒性大和效率低等弊端显著，这就使得开发出具有低毒性、来源于药用植物的新型α-glucosidase抑制剂迫在眉睫，而且这也是迫切需要和亟需解决的问题。多种中草药的提取液中进行α-glucosidase活性的抑制实验结果表明，五味子、桑叶、大黄、虎杖等[10-11]对α-glucosidase具有良好的抑制效果；食品中含有很多功能性因子具有降血糖的功能，研究发现，豆制品包括豆鼓和腐乳等对α-glucosidase有较强的抑制活性[12]，这可能是由于豆制品自身的降血糖功能因子和微生物发酵物[13]共同对α-glucosidase抑制的结果。Kwon等[14]研究了8种茄子提取物对α-glucosidase活性的抑制作用，研究发现，茄子中酚类分子的含量会直接影响到α-glucosidase活性的抑制大小。此外，乌龙茶、沙丁鱼活性多肽以及食品添加剂D-木糖都对α-glucosidase具有良好的抑制作用。在本试验中发现，葛根素表现出了良好的α-glucosidase抑制效果，且这种抑制作用具有浓度依赖性，随后的动物实验发现，葛根素能够显著的降低饭后小鼠的血糖，这很可能是由于黄酮类化合物的构效效应引起的；此外葛根素具有多种药理活性，且其低毒性的特点对引起人体的的副作用的概率大大降低，很值得临床推广。

国内外研究表明[15-16]，抑制剂对相关疾病有关的酶的抑制作用呈现可逆的竞争性作用时，这时可以根据酶活性的高低，通过有效的控制抑制剂药物的剂量，来高选择性、可逆的降低酶的活性，而不是使酶彻底的失活，而引起其他不良反应，在我们的研究中发现葛根素是典型的竞争性抑制剂，这表明葛根素会以非共价力，高选择性的结合到α-glucosidase的活性中心，可逆与底物竞争活性位点，从而达到抑制的效果；除上述所列出的α-glucosidase抑制剂类型外，还有包括动物和微生物来源的抑制剂等。虽然现在很多合成药物在临床糖尿病的治疗中起到了很好的治疗效果，但是对人体的毒副作用也是不可小视的。例如，此类药物服用一段时间后会出现肠鸣音亢进的反应，还会出现腹痛、腹胀、排气增多等胃肠功能的紊乱和皮肤反应[17]。因此天然植物来源的抑制剂越来越来成为降血糖药物开发的重点，然而植物成分的药理药效不明，会制约了降血糖药物的开发，因此探讨天然活性成分对α-glucosidase抑制机理的研究也是现在迫切需要的，本课题中的研究表明葛根素是一种可逆的竞争型α-glucosidase,诱导了酶活性的降低；与阳性对照阿卡波糖对比，葛根素能够明显的抑制大鼠血糖水平的增长，对调节血糖水平起到重要作用，为临床降血糖提供了理论基础。

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(编校：谭玲)

Study of the inhibitive mechanism of puerarin on α-glucosidase

XU Ting,CHU Jiang-hong,DING Ping-ying,NI Lian-songΔ

(Department of Endocrinology, Taizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University, Lin hai 317000, China)

ObjectiveTo study the inhibitory mechanism of puerarin on α-glucosidase.Methods40 male mices were divided into 5 groups:control group,acarbose group, puerarin(2.5,5.0,10) μM group,8 mices in each group.Studied the inhibitory effect and inhibition kinetics of puerarin on α-glucosidase by enzyme inhibition kinetics method,and spectrophotometer was used to determine the effect of puerarin on blood glucose change in mices.ResultsPuerarin was a reversible competitive α-glucosidase inhibitor, the value half inhibition concentration (IC50) and inhibition constant (Ki) were obtained to be (4.32±0.42) μM and (0.41± 0.09) μM, respectively.Compared with acarbos,puerarin could inhibite the increase of the blood glucose levels. ConclusionPuerarin as a competitive α-glucosidase inhibitor, can reduce the enzyme actiuity, and play an important role in fall blood ylucose level.

puerarin; α-glucosidase; inhibitory effect; blood glucose levels; diabetes

浙江省医药卫生科技计划项目(2011KYA160)

徐婷，女，本科，副主任医师，研究方向：糖尿病慢性并发症及治疗研究，E-mail：xutingdoc@163.com；倪连松，通讯作者，男，硕士，研究生导师，研究方向：糖尿病慢性并发症发病机制及治疗研究，E-mail：412168451@qq.com。

R285

A

1005-1678(2015)01-0043-04