青藤碱对小鼠复发性自然流产妊娠结局的影响及其相关机制研究

肖丽,李坤

(1.山东省交通医院 妇产科，山东 济南 250031；2.山东省医学科学院附属医院 妇产科，山东 济南 250031)



青藤碱对小鼠复发性自然流产妊娠结局的影响及其相关机制研究

肖丽1,李坤2

(1.山东省交通医院 妇产科，山东 济南 250031；2.山东省医学科学院附属医院 妇产科，山东 济南 250031)

目的 研究青藤碱对复发性自然流产模型小鼠妊娠结局的影响及相关机制。方法 雌性CBA/J小鼠60只，雄性DBA/2小鼠20只、Balb/c小鼠10只，按雌雄比例2:1合笼，检出阴栓者计为妊娠第1天。分为正常组：雌性CBA/J小鼠×雄性Balb/c小鼠，正常饮食，9只孕鼠；模型组：雌性CBA/J小鼠×雄性DBA/2小鼠，正常饮食，10只孕鼠；治疗组：雌性CBA/J小鼠×雄性DBA/2小鼠，自检出阴栓日开始改用含有0.5%青藤碱的饲料，10只孕鼠。计数存活胚胎数和丢失胚胎数，并计算胚胎丢失率。使用ELISA法检测血清中细胞因子IFN-γ和IL- 4的水平；real-time PCR检测IL-4、INF-γ、GATA-3、T-bet基因的表达水平；Western blot测IL-4、INF-γ、GATA-3、T-bet蛋白的表达水平。结果 胚胎丢失率结果表明：与模型组比较，正常组和治疗组的胚胎丢失率显著降低(P<0.01)。ELISA结果显示：与正常组相比较，模型组和治疗组中血清IFN-γ和IFN-γ/IL-4的水平均显著升高(P<0.01)，IL-4水平均显著降低(P<0.01)；与模型组相比较，治疗组中血清中IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4 比值均显著降低(P<0.01)，而IL-4水平变化不大。Real-time PCR和Western blot的结果均显示：与正常组相比较，模型组和治疗组中IL-4、GATA-3 基因的表达水平均显著降低(P<0.01)；IFN-γ、T-bet 基因的表达水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3比值均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，治疗组中IFN-γ、T-bet 基因的表达水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 比值显著降低(P<0.01)。结论 青藤碱可以减少复发性自然流产的发生，其中RSA与Th1/Th2 平衡漂移至Th1 型有关；青藤碱治疗复发性自然流产的可能机制为降低体内Th1型细胞因子IFN-γ及转录因子T-bet 的水平，从而调节Th1/ Th2 平衡。

青藤碱；复发性自然流产；INF-γ；IL-4；T-bet；GATA-3

目前免疫型复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)的主要表现为正常妊娠免疫反应失衡， 涉及到特异性人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)表达增加， 1型辅助性T细胞(helper T cell-1，Th1)/2型辅助性T细胞(helper T cell-2，Th2)的细胞因子平衡失调等致流产。治疗主要采用免疫治疗方案[1-2]， Th1 以分泌 白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等为主，这些细胞因子起免疫杀伤作用，直接或间接损害早期胎盘细胞分化和生长，对胚胎发育有毒性作用，可以导致流产；Th2 以分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 及IL-13 等为主，这些因子主要介导 B细胞增殖抗体生成，辅助体液免疫，产生和介导同种排斥反应的免疫耐受。国内外的研究证明，Th1 与 Th2 细胞因子平衡与妊娠结局关系密切[4]。对于自身免疫型RSA 的治疗主要为抑制免疫性炎症和阻止血栓形成，常用的药物有肾上腺皮质激素如泼尼松，抗凝药物如低分子肝素和小剂量阿司匹林[5-7]。同种免疫型RSA 主要采取主动免疫治疗，在临床上可以采用患者丈夫的淋巴细胞进行脱敏，促进母体产生保护性封闭因子，从而抑制母胎免疫排斥反应以保护妊娠[8-9]。

祖国医学对RSA 认识已久，对其辨证分型以及治疗也有较为系统的研究，许多中药制剂如助孕Ⅰ号、Ⅱ号，养血安胎颗粒，柴苓汤等都被用来治疗RSA，并取得了一定的疗效[10-12]。青藤碱(sinomenine，SIN)是从中药青风藤中提取出来的一种单体生物碱，目前药用的多为青风藤的盐酸盐。青藤碱有明显的抗炎作用，可以在不同程度上抑制体液免疫和细胞免疫。有研究表明，青藤碱对人外周血和小鼠脾淋巴细胞有抑制作用[13]，对T 细胞的活化和Th1 型细胞因子的释放也有抑制作用[14]。尽管青藤碱药理作用很广泛，但是目前青藤碱的临床应用主要在治疗风湿病、心律失常和强直性脊柱炎，近年来，也用于治疗慢性肾炎、肾小球疾病和肿瘤等，但青藤碱用于治疗复发性自然流产则少见报道。本研究首先建立RSA的小鼠模型，再通过比较正常妊娠、自然流产模型和青藤碱治疗各组孕鼠胚胎丢失率的变化，并检测各组孕鼠Th1和Th2型细胞因子、相关转录因子的表达变化和Th1和Th2型细胞平衡情况(IFN-γ/IL-4、T-bet/GATA-3 比值反映) ，旨在探讨青藤碱对RSA是否有治疗作用及可能的治疗机制。

1 材料及方法

1.1 实验动物 健康雌性CBA/J(60只)、雄性DBA/2(20只)购自北京华阜康生物科技股份有限公司(许可证号：SCXK(京)2009-0015)；Balb/c雄性小鼠(10只)购自湖北省疾病预防控制中心(许可证号：SYXK(鄂)2008-0014)，所有动物均是SPF级，8周龄，平均体质量(85±3.55)g。

1.2 药品与试剂 含有0.5%青藤碱的饲料(青藤碱购于上海融禾医药科技发展有限公司，0.5%青藤碱饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司加工合成)；RT-PCR试剂盒(Fermentas 公司)；SYBR Premix Ex TapTM(Takara，宝生物工程有限公司)；IL-4、IFN-γ、GATA3 和T-bet 上下游引物(上海生工生物工程有限公司)；RIPA裂解液(碧云天生物技术研究所)；十二烷基磺酸钠(SDS)(美国Sigma 公司)；苯甲基磺酰氟(PMSF)(杭州碧云天生物技术研究所)；BCA 蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒(武汉谷歌生物科技有限公司)。

1.3 动物分组 所有动物均饲养于实验动物中心SPF动物房，自由饮食饮水，饲养环境相同。适应性喂养2天后，将雌性CBA/J随机分为3组，每组20只，分别与雄性DBA/2和Balb/c小鼠按雌雄比例2:1合笼交配，合笼后第2天早上8点检测雌鼠阴栓，检出阴栓者计为妊娠第1天，分别建立模型。

从每组20只中随机选取10只模型建立成功的小鼠分为：正常妊娠组(以下简称正常组)(CBA/J、BALB/c)：9只，正常饮食；自然流产模型组(以下简称模型组)(CBA/J、DBA/2)：10只，正常饮食；青藤碱治疗组(以下简称治疗组)(CBA/J、DBA/2)：10只，自检出阴栓日开始改用含有0.5%青藤碱的饲料。本文所有实验严格遵循《实验动物保护条例》。

1.4 观察指标

1.4.1 各组胚胎丢失率：妊娠第13天内眦静脉取血后，颈椎脱臼法处死各组CBA/J 小鼠，打开腹腔，暴露子宫，用眼科剪刀分离出子宫，用生理盐水洗净后置于干净滤纸上，计数存活胚数和丢失胚胎数，并计算胚胎丢失率(R)。

胚胎丢失的判断：丢失胚胎的体积明显缩小，胎儿-胎盘单位有明显的出血或坏死，胚胎组织变性或坏死；

胚胎丢失率的计算：胚胎丢失率(R)=丢失胚胎数/(丢失胚胎数+存活胚胎数)×100%，观察时间为妊娠第13天。

1.4.2 血清中IFN-γ和IL- 4的水平：血清细胞因子水平的测定按照ELISA 试剂盒操作程序进行；测定：以空白孔调零，在450 nm 波长下测量各孔的吸光度值(OD 值)；测定需要在加入终止液后15 min 内进行。

1.4.3 蜕膜组织中IFN-γ、IL- 4 、GATA-3及T-bet 基因的表达水平：取0.2 mL无RNA酶的EP管，加入RNA模板5 μL，Oligo(dT)15(10 μM)2 μL，dNTP(2.5 mM) 2 μL，用DEPC处理水调整体积至14.5 μL，70 ℃处理5 min，短暂离心后置于冰上，再依次加入5×缓冲液4 μL；RNA酶抑制剂 0.5 μL；M-MuLV 反转录酶 1 μL；DEPC水调整总体积至20 μL震荡混匀后离心，设置反应条件为：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。得到的cDNA 产物-20 ℃保存备用。以逆转录得到的cDNA 产物为模板，扩增IFN-γ、IL- 4 、GATA-3及 T-bet的序列。PCR反应体系总体积20 μL，其中2×SYBR Premix ExTapTM10 μL, 2.5 μmol/L 引物 2 μL(上下游各1 μL), 50×ROX Reference DyeⅡ0.4 μL, cDNA temples 1 μL, dH2O 6.6 μL。设置反应条件为：95 ℃ 30 s 预变性,95 ℃5 s，60 ℃ 34 s，60 ℃ 60 s，共40 个循环；60 ℃ 34 s收集荧光信号。每1个样本做 3 个平行管。基因表达的相对变化采用△△Ct 法处理。统计分析时△Ct 表示基因的相对定量，Ct 值表示目的基因产物达到阈值所需要的循环数。△Ct=△Ct(样品)-△Ct(内参)，△△Ct=△Ct(样品)-△Ct(标准)。

1.4.4 蜕膜组织中IFN-γ、IL- 4 、GATA-3及T-bet蛋白的表达水平：蛋白浓度测定按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行；570 nm波长检测各管蛋白吸光度；绘制蛋白浓度曲线，计算各样品蛋白浓度；用PBS将蛋白样品浓度稀释至5 μg/μL，EP 管分装，-70 ℃保存。

2 结果

2.1 胚胎丢失率 本实验中共30 只雌鼠，中途意外死亡1 只。各组胚胎丢失情况见表1。与模型组比较，正常组和治疗组的胚胎丢失率显著降低(P<0.01)。

表1 各组孕鼠胚胎丢失率

*P<0.01，与模型组相比较，compared with model group

2.2 ELISA检测血清中IFN-γ、IL- 4 水平 以各组孕鼠子宫蜕膜组织中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4蛋白的表达水平见表2。与正常组相比较，模型组和治疗组中血清IFN-γ和IFN-γ/IL-4的水平均显著升高(P<0.01)，IL-4 水平均显著降低(P<0.01)；与模型组相比较，治疗组中血清中IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4 比值均显著降低(P<0.01)，而治疗组的IL-4水平变化不大。

表2 各组血清IFN-γ、IL- 4 和IFN-γ/IL-4水平

#P<0.01，与正常组相比，compared with normal group；*P<0.01，与模型组相比，compared with model group

2.3 各组蜕膜中IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 基因的相对表达量 由IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 和GAPDH 基因的扩增曲线和熔解曲线(见图1)，所有基因的扩增效率均恒定，已达到平台期，Ct 值即阈值循环数稳定；熔解曲线均呈单峰，表示引物的特异性好，无引物二聚体产生。故可以使用该体系对目的基因进行定量分析。

图1 IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 和GAPDH 基因的扩增曲线和熔解曲线Fig.1 Amplification curve and melting curve of IFN-γ, IL-4, GATA-3, T-bet and GAPDH gene

按照公式相对表达量RQ(relative quantity)=2-△△Ct分别计算各组孕鼠子宫蜕膜组织中IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 基因的相对表达量，见表3。与正常组相比较，模型组和治疗组中IL-4、GATA-3基因的表达水平均显著降低(P<0.01)，差异有统计学意义；IFN-γ、T-bet 基因的表达水平以及IFN-γ/IL-4比值、T-bet/GATA-3 比值均显著升高(P<0.01)，差异有统计学意义。与模型组相比，治疗组中IFN-γ、T-bet 基因的表达水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 比值显著降低(P<0.01)，差异有统计学意义。

表3 各组IFN-γ、IL- 4、GATA-3和T-bet 基因的相对表达量

#P<0.01与正常组相比，compared with normal group；*P<0.01，与模型组相比，compared with model group

2.4 Western blot检测蜕膜中IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 的水平 以各组孕鼠子宫蜕膜组织中IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet蛋白的表达水平与GAPDH 蛋白的表达水平的比值作为各蛋白的相对表达量，见表4。与正常组相比，模型组和治疗组中IL-4、GATA-3蛋白的表达水平均显著降低(P<0.01)，IFN-γ、T-bet 蛋白的表达水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 比值均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，治疗组中IFN-γ、T-bet蛋白的表达水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 比值显著降低(P<0.01)。蛋白条带图可以看出IFN-γ、T-bet 、GATA-3、IL-4的表达情况，见图2。

表4 各组IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 蛋白的相对表达量

#P<0.01，与正常组相比，compared with normal group；*P<0.01，与模型组相比，compared with model group

图2 各组IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 蛋白表达1-3 正常组;4-6 模型组;7-9 治疗组Fig.2 The protein expression levels of IFN-γ,IL- 4,GATA-3,T-bet 1-3 normal group; 4-6 model group;7-9 treatment group

3 讨论

RSA发生与Th1/Th2平衡有关，以Th1来源的 IL-2，IFN-γ等不利于妊娠，导致流产。而以Th2来源的IL-4等有利于妊娠。研究证实，IFN-γ产生减少与Thl型反应减弱有关，T-bet 的表达与 IFN-γ的诱导产生一致[15]。研究显示，T-bet 选择性表达于 Th1 细胞而非 Th2 细胞[16]，T-bet 小鼠显示 Th1 极化的缺陷。T-bet还可下调 GATA-3 基因表达。T-bet 和 GATA-3通过染色质的改型分别激活 Th1 细胞因子 IFN-γ 和Th2 细胞因子 IL-4的转录。 细胞毒性 T 细胞抗原 4(cycotoxic T lymphocyte associtated antigen-4，CTLA4)可抑制 GATA-3 mRNA 表达和 Th2 细胞分化。 报道显示[18-19]，转导子 GATA连接蛋白-3(GATA-3)和T细胞表达的 T 盒(T-bet)与 Th1/Th2平衡有关。因此，对妊娠结局而言，重要的是Th1/Th2的平衡。 在自然流产小鼠模型的相关研究中也发现， 流产的发生与Th1型细胞因子增高，Th2型细胞因子下降有关；外源性抗原诱导妊娠免疫耐受的机制可能与其促使Th1向 Th2转化，从而降低胚胎吸收率有关，中国最新研究表明，蜕膜组织中T-bet和GATA-3 表达异常与 URSA 发病相关[17]。

有研究报道，青藤碱可以对IL-2 膜受体的表达产生抑制作用，但是不影响IL-2 的分泌，提示青藤碱治疗风湿性关节炎的机制之一是调节细胞因子的产生，抑制IL-2 膜受体[20]。另有研究认为慢性肾炎患者的外周血有核细胞中T-bet mRNA 的水平高于健康对照组，给予青藤碱治疗后，T-bet mRNA 的高水平被抑制，同时血清中IFN-γ的水平也被抑制。T-bet 对 Th1细胞因子有正性调节作用，而 GATA-3 则正性调节 Th2细胞因子的分泌，因此，T-bet/ GATA-3 的比率是一个反映 Th1/ Th2平衡的很好的指标。有研究检测原因不明的 RSA 妇女蜕膜组织中 T-bet、GATA-3 的表达，发现 T-bet 表达增加而 GATA-3 表达下降，表明 T-bet、GATA-3 也参与了 RSA的发病过程。 本研究中，T-bet 和 GATA-3 在各组中的表达变化分别与 IFN-γ和 IL-4 的变化一致，即模型组孕鼠蜕膜组织中T-bet mRNA和蛋白表达量明显高于正常组，而GATA-3 明显低于正常组，提示 T-bet、GATA-3 表达的变化与 RSA有密切联系，与以往研究结论一致[20]。这些研究均提示青藤碱可以直接或者间接抑制Th1 型细胞因子IFN-γ 和转录因子T-bet 的表达，从而影响Th1/ Th2 平衡。

多项研究表明，以 Th2型细胞因子为主的 Th1/Th2平衡可以导致免疫耐受从而维持正常妊娠，而RSA的免疫应答过程则表现为以Th1型细胞因子为主的Th1/Th2失衡[13]。本研究亦发现，模型组孕鼠蜕膜组织中 IFN-γmRNA和蛋白表达量以及外周血中 IFN-γ水平均明显高于正常组，而IL-4明显低于正常组，与以往研究结论一致，即 Th1 型细胞因子可以导致胎盘损伤胎儿发育受阻而引起流产，Th2 型细胞因子则对胎儿生长发育和维持妊娠有一定作用，RSA 的发生于 Th1/Th2 平衡偏向 Th1型有关。同时本研究中IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 蛋白表达量与低于模型组但是高于正常组且有统计学差异，说明青藤碱可以调整Th1/Th2失衡情况。

本研究中，青藤碱可以减少复发性自然流产的发生，其中RSA与Th1/Th2 平衡漂移至Th1 型有关；青藤碱治疗复发性自然流产的可能机制为降低体内Th1型细胞因子IFN-γ及转录因子T-bet 的水平，从而调节Th1/ Th2 平衡。

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(编校：王冬梅)

Research the influences of sinomenine on pregnancy outcome of mice with recurrent spontaneous abortion and its mechanism

XIAO Li1,LI Kun2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology,Traffic Hospital in Shandong Province, Jinan 250031, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Shandong Provincial Academy of Medical Sciences, Jinan 250031, China)

ObjectiveTo investigate the influences and the mechanism of sinomenine on pregnancy outcome of mice with recurrent spontaneous abortion.MethodsAccording to the proportion of female and male 2:1 cage,60 female CBA/J mice, 20 male DBA/2 mice,10 Balb/c mice, it was detection of pessary which counted as first day of pregnancy.It was divided into three group,the normal group：female CBA/J mice×male Balb/c mice, normal diet,9 pregnant mice;Model group: female CBA/J mice×male DBA/2 mice, normal diet,10 pregnant mice;treatment group: female CBA/J mice×male DBA/2 mice, when self checking out the vaginal plug day, the mice were fed with containing 0.5% of sinomenine, 10 pregnant mice.Counting the number of embryos and embryos survive loss, and calculated the rate of embryo loss.ELISA method was used for the detection of serum cytokines, IFN-γ and IL- 4 level;the expression level of IL-4, INF-γ, GATA-3, T-bet gene were detected by real-time PCR;the level of IL-4, INF-γ, GATA-3, T-bet protein were measured by Western Blot method.ResultsRate of embryo loss results showed that: compared with the model group, the rate of embryo loss of the normal group and the treatment group was decreased significantly(P<0.01), the difference was statistically significant.ELISA results showed that: compared with the normal group, model group and treatment group in serum IFN-γ and IFN-γ/IL-4 levels were significantly increased (P<0.01), the levels of IL-4 were significantly decreased (P<0.01), the difference was statistically significant; compared with the model group, the treatment group in serum IFN-rlevel and the ratio of IFN-γ/IL-4 were significantly decreased (P<0.01), but the level of IL-4 changed little, no significant difference.The results of real-time PCR and Western blot indicated that compared with the normal group, the expression level of IL-4 and GATA-3 genes in model group and treatment group were significantly decreased (P<0.01); the expression level of IFN- γ, T-bet gene and IFN-γ/IL-4 ratio and T-bet/GATA-3 ratio were significantly increased (P<0.01).Compared with the model group, the expression level of IFN- γ, T-bet gene and IFN-γ/IL-4 ratio, T-bet/GATA-3 ratio in treatment group was significantly decreased (P<0.01). ConclusionSinomenine can effectively reduce the occurrence of recurrent spontaneous abortion.RSA and Th1/Th2 relate to drift balance to Th1,mechanism of sinomenine in treatment of recurrent spontaneous abortion may be to reduce the levels of Th1 type cytokines IFN-γ and transcription factor T-bet levels, thereby regulating the balance of Th1/ Th2.

sinomenine; recurrent spontaneous abortion; INF-γ; IL-4; T-bet; GATA-3

山东省自然科学基金课题项目(ZR2009CL027)；济南市科技局科技明星计划课题项目(20100118)；山东省医学科学院医学基金课题项目(201023)

肖丽，女，硕士，主治医师，研究方向：子宫内膜异位症发病机制及诊疗，E-mail：xl1821460022@163.com。

R714.21

A

1005-1678(2015)01-0063-05