人附睾蛋白4在上皮性卵巢癌组织及血清中表达

周哲，蒋欣，宋继成（连云港市妇幼保健院妇科，江苏222000）

人附睾蛋白4在上皮性卵巢癌组织及血清中表达

周哲*，蒋欣，宋继成
（连云港市妇幼保健院妇科，江苏222000）

目的：探讨人附睾蛋白4（HE4）在卵巢癌患者组织及血清中的表达及临床意义。方法：选取卵巢癌患者40例、卵巢良性肿瘤30例及对照组30例，用免疫组化法检测组织中HE4蛋白表达水平，应用酶联免疫吸附试验检测血清中HE4水平。结果：HE4在卵巢癌组患者的血清及组织中的表达高于卵巢良性肿瘤及对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。术前HE4血清水平与卵巢上皮癌患者的病理类型（r=0.25，P=0.022）、组织学分级（r=0.43，P=0.001）、临床分期（r=0.51，P=0.001）、有无淋巴结转移（r=0.22，P=0.027）均呈正相关；与年龄无相关性（P=0.124）。结论：检测卵巢癌组织及血清中HE4水平，可作为卵巢癌诊断、评价其恶性进展的参考指标，可用于指导临床综合治疗。

卵巢癌；人附睾蛋白4；免疫组织化学法；酶联免疫吸附试验

[Abstract]Objective:To research on the appearance in tissue and serum and the clinical significance of human epididymis protein 4(HE4)in patients with ovarian cancer.Methods:This research was based on the treated cases of 40 patients with ovarian cancer and 30 cases of benign ovarian tumor and 30 cases of normal control group from January,2011 to October,2013 in Lianyungang Maternal and Child Health Care Hospital.Results:The appearance of HE4 in the serum and tissue ovarian cancer patients was higher than that of benign ovarian tumor and normal control group,and the difference was statistically significant（P<0.01）；the positive appearance rate of Ovarian tissue HE4 was statistical significance in the pathological type,clinical stage,histological grade and lymph node metastasis（P<0.05）.Conclusions:The appearance of HE4 in Ovarian cancer tissue and serum is associated with the extent and the degree of illness,which can be used as a diagnosis to the auxiliary early stage ovarian cancer.It can also be used as a mark of curative effect and the index of reference for prognosis evaluation and to guide the clinical comprehensive treatment.

[Key words]ovarian cancer;human epididymis protein 4;immunohistochemistry;enzyme linked immunosorbent assay

卵巢癌在妇科肿瘤中发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌居第3位，占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%。在世界范围内其发病率和病死率均有上升趋势，其致死率却占居首位。这主要是因为卵巢癌早期症状不明显，只有19%的卵巢癌患者在癌组织突破卵巢之前能够被发现，大多数患者就诊时已处于晚期，且容易腹腔转移及复发。卵巢癌被世界卫生组织列为早期发现可提高治愈率的一类疾病。卵巢癌早期治疗5年生存率可达92%，然而晚期卵巢癌5年生存率不足50%[1]，因此寻找理想的生化指标用于卵巢癌早期诊断与治疗是改善预后的关键。人附睾蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）是一种新的盆腔恶性肿瘤标志物，近来受到人们的关注。本文对我院2011年1月—2013年10月收治手术卵巢上皮性疾病70例患者，对其中卵巢癌40例患者组织及外周血血清中HE4的表达水平进行检测，并与卵巢良性囊肿及正常组织进行对照比较,以探讨其在卵巢癌中的临床意义。

1　资料与方法

1.1一般资料卵巢上皮性疾病70例患者根据术后病理学诊断分为2组：（1）卵巢癌组40例，年龄19～71岁，平均（52.0±14.7）岁。其中浆液性乳头状囊腺癌20例，子宫内膜样癌13例，移行细胞癌2例，透明细胞癌3例，黏液性乳头状囊腺癌2例。按国际妇产科联盟（FIGO）2000年手术病理分期标准：早期（I~Ⅱ）14例，晚期（Ⅲ~Ⅳ）26例；低中分化23例，高分化17例；无淋巴结转移者11例，有淋巴结转移者29例。住院后均接受卵巢癌肿瘤细胞减灭术，术后予紫杉醇+卡铂方案规范化疗。（2）卵巢良性肿瘤组30例，年龄22~68岁，平均（48.0±12.7）岁。成熟畸胎瘤11例、浆液性囊腺瘤8例、黏液性囊腺瘤6例、卵巢巧克力样囊肿5例，均行卵巢肿瘤剥除术。同时选择30例因其他疾病行卵巢切除术，术后病理诊断正常卵巢组织为对照组。所有入选患者术前经相关检查已排除高血压、冠心病、肝肾功能异常、甲状腺、乳腺肿瘤等疾病，所有患者入院后经常规知情告知并征得其同意后方采血留样。

图1　卵巢癌组细胞质内HE4强阳性表达（SP法，200×）

1.2方法（1）血清检测：患者入院当天及术后1个月采取清晨空腹肘正中静脉全血3mL，置于未加抗凝剂的真空采血管中，保存在4℃冰箱，3天内离心3000r/min，10～15min后取上清，分装在聚丙烯EP管内。应用血清HE4 ELISA试剂盒（瑞典康乃格），用酶联免疫吸附试验（ELISA双抗体夹心法）检测。正常参考值为0~150pmol/L。（2）组织学观察：组织标本取自术中卵巢癌新鲜组织，以10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片4～5μm厚，常规HE染色观察肿瘤组织学改变。（3）检测组织中HE4蛋白：采用MaxVisonTM快捷免疫组化法，即用型兔抗人HE4多克隆抗体（北京中杉金桥公司），即用型快捷免疫组化MaxVisonTM试剂盒及DAB显色剂（福州迈新生物技术公司）。用已知阳性附睾组织切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。结果判定采用半定量积分法：①按显色深浅评分：0分，不显色；1分，浅黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。②按显色比例评分：1分，显色细胞占细胞总数<25%；2分，显色细胞占细胞总数25%～50%；3分，显色细胞占细胞总数51%～75%；4分，显色细胞占细胞总数>75%。最后以两者乘积得分值作为判定标准：≤2分为阴性（-）；＞2分为阳性（+）。

图2　卵巢良性囊肿组细胞质内HE4弱阳性表达（SP法，200×）

1.3统计学处理应用SPSS13.0软件进行统计学分析。血清HE4水平呈非正态分布，以中位数及范围表示总体水平，组间比较用秩和检验。卵巢癌组织中HE4阳性表达率采用χ2检验。变量之间的相关性分析采用Spearman检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

图3　卵巢正常组织中细胞质内HE4阴性表达（SP法，200×）

2　结果

2.1HE4在各组组织中的表达卵巢癌组HE4阳性32例（80.0%），卵巢良性肿瘤组HE4阳性4例（13.3%），正常卵巢对照组HE4阳性0例。HE4在卵巢癌组（图1）表达水平分别与卵巢良性肿瘤组（图2）及正常卵巢对照组（图3）相比较，差异均有统计学意义（P<0.01）；卵巢良性肿瘤组与正常卵巢对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2HE4在各组血清中的表达血清HE4水平在卵巢癌组(术前)分别高于卵巢良性肿瘤组及正常卵巢对照组，差异均有统计学意义（P<0.01）。卵巢癌组HE4水平术前高于术后，差异有统计学意义（P< 0.01）。卵巢良性肿瘤组与正常卵巢对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3卵巢癌患者术前血清HE4水平与临床病理关系变量间相关性分析结果显示：术前HE4血清水平与卵巢上皮癌病理类型（r=0.25，P=0.022）、组织学分级（r=0.43，P=0.001）、临床分期（r=0.51，P=0.001）、有无淋巴结转移（r=0.22，P=0.027）均呈正相关；与患者是否绝经无相关性（P=0.124），见表2。

2.4卵巢癌组织中HE4表达与不同临床病理特征关系卵巢癌组织中HE4表达阳性率在卵巢浆液性和内膜性癌显著高于其他病理类型者（P<0.01）；III~IV期卵巢癌显著高于I~II期者（P<0.05）；中低分化卵巢癌显著高于高分化者（P<0.05）；淋巴结有转移显著高于无转移者（P<0.05）。而HE4表达阳性率与年龄大小比较无统计学意义（P>0.05），见表3。

表1　HE4在各组血清中的表达（pmol/L）

表2　卵巢癌患者术前血清HE4水平与病理关系（pmol/L）

表3　卵巢癌组织中HE4表达与临床病理因素的关系（例，%）

3　讨论

人附睾蛋白4基因最早是由Kirchhoff等[1]在人附睾上皮细胞中发现，该基因位于染色体20q12~ 13.1上，分泌小分子糖蛋白。研究发现HE4可能作为检测早期卵巢癌的理想标志物，是妇科盆腔良恶肿瘤鉴别诊断的良好指标。2005年Drapkin等[2]应用免疫组织化学法分析,HE4蛋白表达在生殖系统和呼吸上皮被抑制，大多数的非卵巢肿瘤不表达HE4。用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）显示出卵巢癌细胞表达HE4。同时分析出HE4在100%的卵巢子宫内膜样癌、93%的卵巢浆液性癌和50%的卵巢透明细胞癌中表达，但在卵巢粘液性癌及正常卵巢组织中不表达，可作为卵巢癌诊断的指标之一。HE4基因在卵巢癌组织中高表达，在正常卵巢组织中不表达或低表达，因此该基因可能是一个卵巢癌相关基因，该基因的启动子可能是一个卵巢癌特异性的启动子。Bignotti等[3]对卵巢恶性肿瘤患者HE4蛋白表达和血清HE4水平研究结果显示：在卵巢恶性肿瘤患者组织和血清中，HE4血清和蛋白质表达均明显上调。高水平HE4显著降低整体生存率、无疾病进展存活率和无瘤生存期。高水平HE4是进展型卵巢恶性肿瘤的表现形式，其可作为低分化类型卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。本研究显示：卵巢癌组组织及血清中HE4表达与卵巢良性肿瘤组及对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.01），且卵巢癌组术前血清HE4水平高于术后，差异有统计学意义（P< 0.01）。与文献报道一致。

目前认为卵巢癌预后不良的因素有：年龄>60岁，国际妇产科联盟分期III~IV期，组织学分级III级，非浆液性病理类型[4]。近年研究发现：高HE4血清水平与浆液性卵巢癌病理类型及组织学分级差相关。不满意的卵巢癌细胞减灭术后患者和盆腹腔有转移病灶者HE4水平均明显升高[5]。本研究显示：卵巢癌组织中HE4表达阳性率在病理类型、临床分期、组织学分级及淋巴结是否转移比较均有统计学意义（P<0.05），与患者年龄是否超过60岁无明显相关性（P>0.05）。国内外研究也提示：HE4在卵巢癌组织中阳性表达率，均随着卵巢癌的病理分级增高而显著增加,临床分期愈晚表达愈高,有腹腔器官及淋巴结转移者明显高于无转移者[6]。与FIGO分期、病理类型、组织学分级、淋巴结转移呈正相关，与患者年龄无相关。HE4在卵巢癌组织的表达水平随病理分期升高而增高，与术前血清HE4水平呈显著正相关关系。本研究结果表明卵巢癌组织中HE4表达与病变范围、病情程度有关，在一定程度上反映卵巢癌患者临床进展情况。因为组织中HE4表达与血清中HE4水平正相关，所以血清中HE4水平同样能反映卵巢癌进展。

综上所述，组织和血清中HE4的检测对卵巢癌诊断、疗效评价及评估肿瘤的恶性进展方面具有一定意义，作为卵巢癌的肿瘤标志物在临床诊断中具有一定参考价值。

[1]Kirchhoff C，Habben I，Ivell R，et al.A major human epididymis-specific cDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitors［J］.Biol Reprod，1991，45（2）：350-357.

[2]Drapkin R，Von Horsten HH，Lin Y，et al.Human epididymis protein 4（HE4）is a secreted glycoprotein that is overexpressed by serous and endometrioid ovarian carcinomas［J］. Cancer Res，2005，65（6）：2162-2169.

[3]Bignotti E，Ragnoli M，Zanotti L，et al.Diagnostic and prognostic impact of serum HE4 detection in endometrial carcinoma patients［J］.Br J Cancer，2011，104（9）：1418-1425.

[4]禹夜.人附睾分泌蛋白4在妇科肿瘤中的研究进展［J］.国际妇产科学杂志，2013，40（3）：251-254.

[5]Kong SY，Han MH，Yoo HJ，et al.Serum HE4 level is an Independent prognostic factor in epithelial ovarian cancer［J］. Ann Surg Oncol，2012，19（5）：1707-1712.

[6]郭冰沁，俞岚，武世伍，等.HE4、NF-κBp65和MMP-9在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其临床意义［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2011，20（6）：578-583.

The appearance in tissue and serum of human epididymis protein 4(HE4) in patients with ovarian cancer

ZHOU Zhe,JIANG Xin,SONG Jicheng
(Department of Gynaecology,Lianyungang Maternal and Child Health Hospital,JiangSu 222000)

R737.31

A

1006-2440（2015）02-0117-04

周哲，女，汉族，江苏连云港人，生于1968年3月，本科，主任医师。研究方向：妇科肿瘤。

2014-11-10