脂多糖致帕金森病动物模型研究进展

何 欢，吴 霞

(首都医科大学中医药学院，中医络病研究北京市重点实验室，北京 100069)

1 神经炎症与帕金森病

帕金森病(Parkinson's disease，PD)，又名震颤麻痹，1817年由英国医生James Parkinson首先系统描述，常见于中老年人，60岁以上的人群中约2%患有帕金森病，是继阿尔茨海默病之后的第二个最常见的神经系统变性疾病。其病理特点是中脑多巴胺(DA)能神经元的丢失，以及α-突触核蛋白(α-synuclein)为主要成分的路易小体的形成［1］。当中脑黑质致密部多巴胺能神经元丢失大约50%，纹状体内多巴胺浓度降低80%时出现临床症状［2］，包括运动迟缓、震颤、强直、姿势步态失调等运动症状，以及嗅觉障碍、植物神经功能紊乱、抑郁、认知及睡眠障碍等非运动相关的症状。目前，PD的发病机制仍不是很清楚，其主要机制涉及氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋性毒性、神经营养因子缺乏及免疫调节异常等。近些年的研究表明神经性炎症能明显促进帕金森病的进程，尤其是小胶质细胞的激活及促炎性因子、神经毒素的表达，能引起帕金森病患者多巴胺能神经元的丢失［3，4］。小胶质细胞作为中枢神经系统常驻免疫细胞，主要参与脑内的固有免疫反应，能够清除细胞碎片和外来异物，发挥免疫监视功能。当脑组织出现感染、外伤、缺血或是神经变性疾病引起的神经元损伤时，小胶质细胞会被迅速激活，形态逐渐发生改变，从静止的网状结构变成运动的阿米巴形状，并释放大量炎症因子。对于小胶质细胞激活后是发挥神经保护作用还是产生神经毒性作用，一直没有定论［5］。一方面，激活的小胶质细胞通过释放神经营养因子和抗炎因子发挥保护作用;另一方面，大量激活的小胶质细胞通过产生大量氧自由基，如超氧化物、细胞内活性氧、过氧化氢、羟自由基、一氧化氮(NO)以及细胞毒性因子，如白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子 - α(TNF- α)、前列腺素 E2(PGE2)等损伤神经元［3］。此外，损伤的神经元会继续引起小胶质细胞的过度激活，从而在神经元凋亡和小胶质细胞激活之间形成一种恶性循环，导致更多的神经元变性死亡［4］。临床研究发现，在PD患者的黑质纹状体系统中确实存在激活的小胶质细胞［6］。因此，研究PD进程中的炎症反应是必要的，它可以帮助我们理解PD的病理机制并研究有效的治疗药物。

在过去20年间，PD动物模型的研究表明，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的神经炎症可以复制一些PD的特征，包括小胶质细胞的过度激活以及黑质纹状体系统多巴胺能神经元选择性损伤［7～10］。LPS为革兰阴性菌细胞壁的主要成分，是重要的内毒素，能刺激机体产生炎症反应。研究表明LPS进入到脑中可以结合小胶质细胞膜上的CD14样受体，激活Toll样受体4，由此引起小胶质细胞的激活，从而导致神经元的损伤［11］。

2 不同部位给予LPS致PD动物模型

2.1 黑质内注射LPS 中脑黑质区域分布着多巴胺能神经元和大量小胶质细胞，1998年，Castaño等［7］报道了黑质内注射LPS造成PD大鼠模型。在黑质区域立体定位注射LPS后，发现了小胶质细胞激活，并且黑质部位多巴胺能神经元缺失，试验结果表明炎症反应尤其是小胶质细胞的激活对PD的病理进程有重要影响。小胶质细胞为脑内常驻免疫细胞，正常状态下起到免疫监视作用，其形态为静止的分叉状，当接触到致炎因子后，小胶质细胞会过渡到棒状的激活状态，继而变成阿米巴样的完全激活状态。急慢性黑质内注入LPS实验表明，LPS可以诱导小胶质细胞激活，并且有剂量和时间依赖性［12，13］。Herrera 等［14］在随后的研究中，通过观察注射LPS一年后大鼠黑质多巴胺能神经元存活情况，证明LPS诱导的多巴胺能神经元损毁是不可逆的。而且，LPS对DA能神经元的损害作用具有选择性，可以观察到LPS在损毁黑质DA能神经元的同时，γ-氨基丁酸(GABA)能神经元和5-羟色胺(5-HT)能神经元并不受影响。此后，更多的研究证实了上述结果，并发现在注射LPS后，黑质部位促炎性细胞因子包括IL-1β、TNF-α、IL-6和NO等水平增高，这些促炎性细胞因子可能是LPS致神经元损伤的起因［15～17］。此外，黎钢等［18］探究了 LPS 对大鼠行为学和单胺类递质的影响，结果表明LPS注入黑质特异性损害DA能神经元，可降低纹状体DA及其代谢产物含量，阿朴吗啡可诱导大鼠产生旋转行为。

LPS立体定位注射到中脑黑质区域可更好模拟小胶质细胞激活和神经元损伤之间的相互作用，有利于研究黑质区域炎症对PD病理变化的影响。

2.2 苍白球内注射LPS 苍白球是位于大脑两侧半球深部的基底核的重要组成部分，基底核是锥体外系的中继核，可以将来自大脑皮质、丘脑等处的神经冲动经苍白球发出纤维至丘脑而与大脑皮质联系。苍白球的下行纤维，通过红核、黑质、网状结构等影响脊髓下运动神经元。因此，基底核作为一个整体，苍白球可以影响到黑质纹状体的通路和功能。目前已有研究结果表明LPS注射到苍白球可模拟PD的生化及行为改变，如大鼠活动减少、运动迟缓、黑质纹状体系统中酪氨酸羟化酶阳性神经元减少、多巴胺含量降低、小胶质细胞持续活化等。Zhang等［8］将LPS立体定位注射到大鼠苍白球，试验结果显示黑质和苍白球区域小胶质细胞均被激活，黑质致密部TH阳性神经元及其蛋白表达显著减少，并且大鼠自主活动减少。也有研究发现苍白球注射LPS的大鼠促炎性细胞因子水平显著升高，包括IL-1β、TNF-α和IL-6，诱导型一氧化氮合酶表达增多，并增强了α-synuclein在黑质的聚集。与低龄大鼠比较，上述病理变化在中年大鼠中更显著，该结果也支持了老龄化是帕金森病的一个诱因的观点［19］。

2.3 纹状体内注射LPS 在黑质纹状体系统中多巴胺能神经元的胞体位于黑质内，而其富含多巴胺递质的神经纤维分布在纹状体内。研究发现LPS注射到大鼠纹状体后，黑质多巴胺能神经元胞体和纹状体轴突末端逐渐变性死亡，纹状体内多巴胺含量降低，α-synuclein和泛素蛋白在神经元细胞质内积聚，并且大鼠出现行为学障碍［10，20，21］。Hunter等［22］将LPS立体定位注射到C57/B6小鼠纹状体内，试验结果表明LPS能够致小鼠多巴胺能神经元变性缺失，并且呈剂量和时间依赖性，在小鼠纹状体分别注射 5、7.5、10 μg 的 LPS，1周后TH阳性神经元缺失分别达到23%、45%、61%，注射5 μg LPS，4周后TH阳性神经元缺失达到72%、12周后达到81%，并且多巴胺含量显著降低，与对照组相比，LPS组小鼠在转棒上停留的时间明显降低。该研究成功复制了PD相关症状的小鼠模型。

纹状体内注射LPS可引起神经毒性，其分子机制可能有多种，包括黑质和纹状体区域内小胶质细胞的激活、线粒体损伤、以及 IL-1β、TNF- α、IL-6、IL-1α、NO 等促炎性细胞因子的释放。这表明纹状体内的炎症刺激不仅直接损害纹状体内多巴胺能神经元轴突末端，还间接损伤黑质内多巴胺能神经元胞体，其具体信号传导通路有待进一步研究［10，20，22］。

2.4 脑室内注射LPS 李军泉等［23］通过脑室注射 LPS激活脑内炎症反应，观察脑内炎症变化情况，大鼠行为学改变，以及对黑质多巴胺能神经元的影响。结果表明脑室注射LPS后能引起脑室内小胶质细胞的广泛激活，其激活程度随时间而逐渐增高，注射后24 h激活程度最高。黑质部位小胶质细胞激活要晚于纹状体及海马，说明脑室注射LPS后炎症反应在脑内由近及远扩散。Zhou等［24］将LPS注射到大鼠单边侧脑室，在不同时间点观察LPS的长期神经毒性作用。第4周在海马和纹状体的小胶质细胞被激活，而在第24周黑质内小胶质细胞才被激活，TH阳性神经元出现胞体萎缩死亡。α-synuclein在第12周聚集增多，并在24周达到最多，反常的运动行为在第16周出现并持续到了48周。此研究结果表明，侧脑室内注射LPS与黑质或纹状体内局部注射LPS建立的大鼠模型不同，本模型能更好地模拟PD的慢性渐进性变性过程，多巴胺能神经元的损伤较为缓慢，具有时间依赖性。

2.5 腹腔内注射LPS 全身系统性炎症曾被怀疑能否影响脑内免疫细胞激活进而促进PD的神经退行性病变。但有研究表明C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS可引起小胶质细胞的激活和多巴胺能神经元退行性病变，7个月和10个月时多巴胺能神经元丢失分别为23%和43%［25］。腹腔注射的LPS不能进入中枢神经系统引起炎症，早期文献报道内毒素LPS注射到大鼠体内不能破坏血脑屏障的通透性［26］。然而一些促炎性因子包括TNF-α和IL-1，可以通过血脑屏障，直接影响中枢神经系统功能［27］。

细菌内毒素LPS，作为一种小胶质细胞激活剂，当以腹腔注射的形式应用时，会将脑部一些不同区域的小胶质细胞激活，不仅仅是黑质部位，例如LPS也应用于阿尔兹海默病炎症模型［28］，因此，腹腔注射LPS致PD多巴胺能神经元退行性病变的分子机制需要进一步研究。

2.6 经鼻吸入LPS 经鼻通路连接鼻子和大脑，避开了血脑屏障，因此，空气中的一些毒性物质可以通过经鼻通路进入大脑，影响大脑的功能。2013年，有学者通过LPS经鼻吸入途径成功制备了小鼠PD模型［29］，每只小鼠隔天右侧经鼻滴注LPS 10 μg，时间为5个月，实验结果表明LPS单侧经鼻吸入可引起小鼠运动功能减退，黑质多巴胺能神经元丢失及α-synuclein的沉积，纹状体内TH表达减少及DA等神经递质释放减少。该模型呈现了PD的典型特征，可以用来研究慢性炎症介导的PD发病机制以及发现以小胶质细胞-神经元相关联的PD治疗方法。李艳花等［30］采用LPS长时间、低剂量滴鼻方式给予C57BL/6小鼠，亦成功获得了理想的PD模型，结果显示鼻腔吸入LPS可以诱导小鼠运动功能改变，引发黑质多巴胺能神经元的丢失、激活小胶质细胞及其NF-κB信号通路。

3 小结

根据LPS不同作用部位，可以将LPS致PD模型概括为两类，第一类为LPS直接局部注射到黑质纹状体系统或其相关结构，例如LPS立体定位注射到黑质、纹状体、苍白球和脑室;第二类为LPS间接地全身给药，选择性影响黑质纹状体系统，例如腹腔注射LPS和经鼻吸入LPS。研究表明，由于多巴胺能神经元与小胶质细胞在共同区域，且多巴胺能神经元更容易受到炎症介导的神经元损伤，因此第一类模型更容易导致多巴胺能神经元的选择性损伤。黑质立体定位注射LPS，可以直接诱导小胶质细胞的激活，造模时间短，但是由于黑质结构小，定位较难，且容易导致局部机械性损伤。纹状体、苍白球和脑室内注射LPS不会引起黑质局部机械性损伤，但其成模时间较长。第二类模型中，LPS如何致使黑质纹状体系统多巴胺能神经元选择性死亡至今仍不是很清楚，其具体分子机制需要进一步研究。因此第一类模型更适合应用于炎症介导PD的病因学研究。

PD模型的建立在阐明PD发病机制、发现药物作用靶点、新药研发和筛选等方面具有重要意义，因此，建立一个稳定可靠的PD实验模型对研究PD的发病和治疗显得尤为重要。大量研究表明，以小胶质细胞激活为代表的免疫炎症在PD的发生和发展中扮演重要作用。在LPS致PD动物模型中，LPS可刺激小胶质细胞激活，引发神经炎症，诱导黑质多巴胺能神经元产生一系列病理生理变化，能较好的模拟PD发病机制中的免疫炎症机制，为研究PD进程中的炎症反应奠定了基础。此外，LPS致PD动物模型也为筛选以神经炎症为靶点的PD治疗药物提供了可靠的工具。

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