鸢尾素改善载脂蛋白E基因敲除糖尿病小鼠动脉粥样硬化

卢俊颜，向光大，梅稳，刘敏，向林，董靖

鸢尾素改善载脂蛋白E基因敲除糖尿病小鼠动脉粥样硬化

卢俊颜，向光大，梅稳，刘敏，向林，董靖

目的：探索鸢尾素（Irisin）对动脉粥样硬化的作用及其可能机制。

方法：建立载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠糖尿病模型（n=20）并分为鸢尾素组（n=10）、糖尿病对照组（n=10），同时设立空白对照组（n=10），分别静脉注射鸢尾素或等量生理盐水。鸢尾素干预4周后，测定血管内皮依赖性舒张功能。干预12周后，检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、C-反应蛋白、白细胞介素-6（IL-6）及氧化低密度脂蛋白等炎性因子水平；油红O及苏木素伊红（HE）染色分析主动脉粥样斑块表面积及横断面积；抗CD68和抗CD90免疫组化染色测定斑块巨噬细胞及T淋巴细胞浸润；实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）分析主动脉壁IL-6、白细胞介素-10、TNF-α等炎性因子信使核糖核酸 （mRNA） 转录水平。

结果：鸢尾素组与糖尿病对照组相比，小鼠内皮依赖性舒张功能改善，血中炎性因子水平降低，粥样斑块表面积[（22.57 ± 2.17）% vs（35.09 ± 2.38）%，P＜0.05]及横断面积[（19.36 ± 1.85）% vs（25.53 ± 7.87）%， P＜0.05]减小，斑块巨噬细胞[（30.5±2.79）% vs（41.34±9.13）%]、T淋巴细胞[（28.11±4.24）% vs（35.79±9.11）%]浸润减少，主动脉壁炎性因子mRNA转录水平下降[IL-6：1.76 ± 0.50 vs 3.78 ± 1.15；TNF-α：1.05 ± 0.30 vs 2.11 ± 0.48；细胞内黏附分子-1：1.96 ± 0.69 vs 2.71 ± 0.72；血管细胞黏附分子-1： 0.87 ± 0.21 vs 1.45±0.25；单核细胞趋化蛋白-1：1.34 ± 0.34 vs 1.77 ± 0.55]，差异有统计学意义（P＜0.05）。

结论：鸢尾素可改善ApoE-/-糖尿病小鼠动脉粥样硬化，内皮保护及抗炎反应是其保护血管的重要机制。鸢尾素具有潜在的防治动脉粥样硬化的临床价值。

鸢尾素； 动脉粥样硬化； 糖尿病

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:492.)

流行病学研究表明：约75%糖尿病患者死于血管并发症，而冠状动脉、脑动脉及周围动脉等大血管并发症是致残、致死的主要原因[1,2]。动脉粥样硬化是引起糖尿病大血管并发症的最重要病理改变，因此改善动脉粥样硬化对糖尿病大血管病变的防治具有重要意义。既往研究证实：运动可改善动脉粥样硬化，其机制与减轻胰岛素抵抗、降低体重、纠正血管内皮功能障碍及减轻动脉炎症反应有关。但以上机制并不能直接地解释运动对动脉粥样硬化的改善作用。学者们曾怀疑骨骼肌可能产生某种“肌肉因子”改善动脉粥样硬化，却一直缺乏证据。鸢尾素（Irisin）的发现为此提供了可能的线索。鸢尾素是一种主要由骨骼肌合成和分泌的激素，运动可增加其产生[3]。鸢尾素在体内可将储存能量、导致肥胖的白色脂肪组织转变为消耗能量、减轻体重的棕色脂肪组织[3]，即白色脂肪“棕色化”。动物实验证实：鸢尾素可减轻肥胖C57小鼠的胰岛素抵抗及体重[3]。Moreno-Navarrete等[4]的人体研究揭示：正常、超重及肥胖者血浆鸢尾素水平依次降低，与三者胰岛素敏感性正好相反。正常人与2型糖尿病患者的对比也呈上述表现。我们前期的研究表明：新诊断的2型糖尿病患者血浆鸢尾素浓度与血管内皮功能呈独立正相关[5]。但目前少见文献报道鸢尾素与动脉炎症反应的关系，本研究旨在探索鸢尾素对动脉粥样硬化的作用及机制。

1 材料和方法

实验时间：2013-09至2013-12。无特定病原体（SPF）级4周龄雄性载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠（美国Jackson实验室），高脂饲料（南京青紫兰科技有限公司），链脲佐菌素（美国Sigma公司），鸢尾素（美国Phoenix Pharmaceuticals公司），油红O（美国Sigma公司），酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒[白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）：美国R&D公司；C-反应蛋白（CRP）：德国Immundiagnostik公司；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）：武汉优尔公司；胰岛素：美国EMD Millipore公司；鸢尾素：美国Phoenix Pharmaceuticals公司]，抗CD68（巨噬细胞表面标记分子）及抗CD90（T淋巴细胞表面标记分子）抗体（美国CST公司）。

建立ApoE-/-糖尿病小鼠模型：SPF级4周龄雄性 ApoE-/-小鼠30 只，适应性饲养一周后，随机分为两组，其中糖尿病模型组20只，空白对照组10只，继续以高脂饲料饲养。两组小鼠均禁食12 h后称体重，糖尿病模型组以50 mg/kg链脲佐菌素（1%，柠檬酸盐缓冲液配制）腹腔注射，每天1次，连续5天；空白对照组腹腔注射等量柠檬酸盐缓冲液。建模结束2天后，对两组小鼠进行经腹腔注射葡萄糖耐量试验（IPGTT），筛选糖尿病小鼠。以空腹血糖 ≥ 7. 0 mmol / L和葡萄糖负荷后 2 h 血糖 ≥ 11. 1 mmol / L 作为糖尿病成模标准，20只ApoE-/-小鼠全部建模成功。

ApoE-/-小鼠分组及给药：将糖尿病模型组20只ApoE-/-小鼠以体重和血糖匹配后随机均分至鸢尾素组和糖尿病对照组各10只，鸢尾素组小鼠尾静脉注射2 µg 鸢尾素（生理盐水配制），每周2次，持续12周；糖尿病对照组及空白对照组小鼠尾静脉注射等量生理盐水。

ApoE-/-小鼠主动脉内皮性舒张功能测定：鸢尾素或生理盐水干预4周后，每组随机选取3只小鼠进行内皮依赖性舒张功能测定实验。ApoE-/-小鼠经后腔静脉放血处死后，迅速在体视显微镜下移除主动脉血管鞘及周围结缔组织，取长约4 mm血管环。将血管环悬于挂钩，连接到JH-2张力换能器（成都泰盟科技有限公司），以BL-420S生物信号采集系统记录张力改变。将血管环置于含Krebs液的HV-4离体恒温器官灌流系统（成都泰盟科技有限公司）浴槽中，通入95% O2+ 5% CO2混合气体。予血管环0.5 g张力负荷, 平衡1 h 。血管环用10-6mmol/L去甲肾上腺素预刺激，达平衡状态后，以不同浓度乙酰胆碱（Ach，10-9至10-4mmol/L）及硝普钠（SNP, 10-9至10-4mmol/L）刺激血管环（每次换液前均以Krebs液灌洗2次），记录浓度－张力反应。

ApoE-/-小鼠代谢及血清炎性因子水平检测：每周定期测定各组小鼠体重及血糖。鸢尾素干预4周及12周时，进行IPGTT。12周后，腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥钠麻醉小鼠（7只/组），皮肤消毒后开腹，后腔静脉采血，离心后取血清，ELISA检测胰岛素、糖化血红蛋白（HbA1c）、TNF-α、CRP、IL-6、ox-LDL及鸢尾素水平。

ApoE-/-小鼠主动脉斑块表面积及横断面积测定：每组随机取3只小鼠，经后腔静脉采血后，迅速剖开胸腔，眼科剪移除胸腹腔脏器，保留心脏。生理盐水冲洗主动脉管腔后，4%多聚甲醛固定，PBS液冲洗管腔。体视显微镜下剥离主动脉（升主动脉至两侧髂总动脉），显微剪纵行剖开，剪下后缝合到封口膜上，4%多聚甲醛固定48 h，60% 异丙醇浸泡10 min，油红O 染液浸染3～4 h，60% 异丙醇分化5～7次,直至动脉壁呈白色。照相后用Image-Pro Plus 6.0测定动脉粥样硬化斑块表面积与动脉壁表面积，计算动脉粥样硬化斑块表面积与动脉壁表面积的百分比。

ApoE-/-小鼠腹主动脉以4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋，每隔20 μm连续取8张切片，进行苏木素伊红（HE）染色。显微镜下照相，计算图片中斑块横断面积与腹主动脉管腔面积百分比（Image-Pro Plus 6.0）。

ApoE-/-小鼠主动脉炎性病变测定：各组ApoE-/-小鼠腹主动脉切片进行抗CD68，抗CD90免疫组织化学染色。显微镜下照相，计算图片中阳性染色面积与斑块面积百分比（Image-Pro Plus 6.0）。

每组取3只小鼠，生理盐水冲洗主动脉管腔后迅速剥离血管鞘及周围结缔组织，剪下主动脉，匀浆后提取信使核糖核酸（mRNA），实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）测定主动脉壁IL-6、白细胞介素-10（IL-10）、TNF-α、细胞内黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1 （VCAM-1）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等炎性因子转录水平。内参为β-肌动蛋白（β-actin）。引物IL-6 F: 5’-GTTGCCTTCTTGGGACTGATG-3’，IL-6 R: 5’-GTATAG AC AGGT CTGTTGGGAG-3’；IL-10 F: 5’ CAGTACAG CCGGGAAGAC AA-3’，IL-10 R: 5’-CCTGGGG CATCACTTCTACC-3’；TNF-α F: 5’- CGTCAGCC GATTT GCTATCT-3’，TNF-α R: 5’-CGGA CTCCGCAAAGTCTAAG-3’；ICAM-1 F: 5’-GAGA CGCAGAGGACCTTAACAGT-3’，ICAM-1 R: 5’- GACGCCGCTCAGAAGAACCA-3’；VCAM-1 F: 5’-TGGC TCCAG ACATTT ACC C AGTTT-3’，VCAM-1 R: 5’-GTTCTTTGACA GTCTCCCTTTCTTT-3’；MCP-1 F: 5’-CCAG CA AGATGATCCCAATGAGT-3’，MCP-1 R: 5’-CATTTGGTTCCGATCCAGGTTTT-3’；β-actin F: 5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，β-actin R：5’-TAA AGACC TCTATGCCAACA CAGT-3’。

统计学分析：采用SPSS 19.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）, 组间多重比较用最小显著差异t（LSD-t）检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

鸢尾素对ApoE-/-小鼠代谢及炎性因子水平的影响：鸢尾素干预4周和12周后进行IPGTT，结果显示ApoE-/-糖尿病小鼠糖耐量改善（图1A和1C）。但4周和12周时鸢尾素组与糖尿病对照组相比空腹胰岛素水平并无明显差异（图1B和1D）。如表1所示：与空白对照组相比，干预12周后糖尿病模型组ApoE-/-小鼠体重、胰岛素水平显著降低，而血糖、HbA1c水平显著升高。ApoE-/-糖尿病小鼠血中TNF-α、CRP 、IL-6及ox-LDL等炎性因子较非ApoE-/-糖尿病小鼠显著升高。而鸢尾素组小鼠炎性因子水平明显低于糖尿病对照组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

图1 鸢尾素对ApoE-/-糖尿病小鼠糖耐量的影响(1A和1B，n=10只/组；1C和1D，n=7只/组)

表1 鸢尾素对ApoE-/-糖尿病小鼠代谢及血清炎性因子水平的影响

表1 鸢尾素对ApoE-/-糖尿病小鼠代谢及血清炎性因子水平的影响

注：与糖尿病对照组比*P＜0.05

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鸢尾素对ApoE-/-糖尿病小鼠主动脉血管内皮依赖性舒张功能的影响：鸢尾素组与糖尿病对照组比，乙酰胆碱血管舒张率显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05，图2A），而硝普钠血管舒张率差异无统计学意义（P＞0.05，图2B）。

图2 鸢尾素对ApoE-/-糖尿病小鼠主动脉血管内皮依赖性舒张功能的影响（n=3只/组）

图3 鸢尾素对ApoE-/-糖尿病小鼠主动脉粥样斑块面积的影响（3B和3C， n=3只/组）

鸢尾素对ApoE-/-糖尿病小鼠主动脉粥样斑块面积的影响：糖尿病模型ApoE-/-小鼠主动脉弓出现大量粥样硬化斑块，鸢尾素干预后粥样斑块减少（图3A）。鸢尾素干预显著减小ApoE-/-糖尿病小鼠主动脉粥样斑块面积，差异均有统计学意义（P＜ 0.05，图 3B、3C、3D、3E）。

鸢尾素对ApoE-/-糖尿病小鼠主动脉炎性病变和炎性因子mRNA水平的影响：鸢尾素组与糖尿病对照组比，斑块炎性浸润明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05，图4A、4B）。RT-PCR分析主动脉壁炎性因子mRNA 水平提示（图4C）：鸢尾素组ApoE-/-小鼠与糖尿病对照组相比主动脉壁IL-6、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1等炎性因子mRNA水平下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；IL-10 mRNA水平上调，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

图4 鸢尾素对ApoE-/-糖尿病小鼠主动脉炎性病变及炎性因子mRNA水平的影响

3 讨论

本研究以鸢尾素干预ApoE-/-糖尿病小鼠动脉粥样硬化模型,第一次证明了鸢尾素可降低血中炎性因子水平，改善内皮功能障碍，减小动脉粥样硬化斑块表面积及横断面积,并可减少斑块中巨噬细胞及T淋巴细胞浸润,下调主动脉壁炎性因子转录水平，从而证实鸢尾素具有改善动脉粥样硬化的作用。

胰岛素抵抗是糖尿病患者发生动脉粥样硬化的独立危险因素。胰岛素抵抗可引起“糖毒性”、“脂毒性”及血管内皮功能障碍，加速动脉粥样硬化进展[6]。研究证实：减轻胰岛素抵抗的治疗方法可改善动脉粥样硬化[7]。为研究鸢尾素能否通过减轻胰岛素抵抗而改善动脉粥样硬化，我们在鸢尾素干预4周及12周时进行了IPGTT及空腹胰岛素测定，结果显示：鸢尾素干预4周和12周均可显著改善ApoE-/-糖尿病小鼠糖耐量，而且鸢尾素干预12周后，ApoE-/-糖尿病小鼠空腹血糖和HbA1c水平均有统计学差异。此结果与鸢尾素减轻肥胖C57小鼠糖耐量作用的研究结果一致[3]。因此，减轻胰岛素抵抗可能是鸢尾素改善动脉粥样硬化的机制之一。但是在鸢尾素干预12周后，ApoE-/-糖尿病小鼠体重、空腹胰岛素水平差异均无统计学意义。上述结果提示：减轻胰岛素抵抗并非鸢尾素改善动脉粥样硬化的主要机制；鸢尾素改善糖尿病状态下动脉粥样硬化作用与减轻体重无关。

血管内皮功能障碍是引起动脉粥样硬化的重要发病机制，同时也是早期的病理生理改变[8,9]。通过测定以内皮依赖性舒张功能为代表的内皮功能，可预测动脉粥样硬化的发生风险及预后。改善内皮功能的治疗，也多数能改善动脉粥样硬化[10]。本研究中，各组间非内皮依赖性舒张功能无统计学差异，表明血管舒张反应差异由内皮功能引起，糖尿病模型组ApoE-/-小鼠内皮依赖性舒张功能下降，而鸢尾素可改善糖尿病小鼠内皮依赖性舒张功能。上述结果提示：保护血管内皮是鸢尾素改善动脉粥样硬化的机制之一。

动脉粥样硬化是一种动脉炎症性疾病，炎症反应参与了动脉粥样硬化整个病理过程[11-13]。血中炎性因子水平升高可引起血管内皮功能障碍、凋亡增加，促进动脉粥样硬化的发生和发展。浸润斑块的巨噬细胞、T淋巴细胞可破坏动脉壁正常结构，细胞溶解后还导致斑块不稳定、易破裂。而主动脉壁的炎性因子一方面促进巨噬细胞、T淋巴细胞等黏附和迁移至主动脉壁，另一方面也促进内皮细胞、平滑肌细胞增殖或凋亡（随病情进展有所变化）[11,12]。本研究发现：鸢尾素可降低ApoE-/-糖尿病小鼠血中炎性因子水平，减少ApoE-/-糖尿病小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞、T淋巴细胞浸润，同时可降低ApoE-/-糖尿病小鼠主动脉壁IL-6、TNF-α、VCAM-1等炎性因子转录水平。IL-10被称为“细胞因子合成抑制因子”，具有一定抗炎效应。本研究结果表明，鸢尾素能在一定程度增加ApoE-/-糖尿病小鼠IL-10的表达，从另一方面证实鸢尾素具有抗炎作用。上述结果证明：抗炎症反应是鸢尾素改善动脉粥样硬化的主要机制。

综上所述，本研究证实，鸢尾素可改善ApoE-/-糖尿病小鼠的动脉粥样硬化，其机制是改善胰岛素抵抗和内皮功能障碍，并减轻动脉炎症反应。此研究结果很好地阐释了运动改善动脉粥样硬化的直接原因，因为鸢尾素是人体生理条件下存在的激素，运动增加其循环水平，所以鸢尾素对人体作用是安全的，在动脉粥样硬化的防治方面具有良好的临床应用前景。鸢尾素对人体动脉粥样硬化的作用、代谢动力学及最佳浓度与防治效应的关系等仍需进一步探索。

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Irisin Improving Atherosclerosis Condition in ApoE-/-Diabetes Mellitus Mice

LU Jun-yan, XIANG Guang-da, MEI Wen, LIU Min, XIANG Lin, DONG Jing.
Wuhan Clinical Institute Affiliated to Southern Medical University, Wuhan (430070), Hubei, China

Objective: To explore the effect of irisin on atherosclerosis with possible mechanisms in diabetes mellitus (DM) mice.Methods: A total of 30 ApoE-/-mice were randomly divided into 2 groups: Control group, the mice received citrate buffer solution for modeling control, n=10. DM group, the mice received streptozotocin injection for DM modeling, n=20; the DM group was further divided into 2 subgroups as DM control (DM-C) group, the mice received normal saline injection for 12 weeks and DM + irisin group, the diabetic mice received irisin injection for 12 weeks. n=10 in each subgroup. With 4 weeks of irisin intervention, the endothelium-dependent vasodilatation was detected. With 12 weeks of intervention, the blood levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP), interleukin-6 (IL-6) and oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) were examined by ELISA, the plaque areas in aortic en face and cross sections were measured by Oil red O or HE staining, the macrophages/T lymphocytes infiltration in plaques were detected with immunohistochemistry, and the mRNA expressions of IL-6, IL-10, TNF-α were determined by RT-PCR.Results: Compared with DM-C group, DM + irisin group presented improved endothelium-dependent vasodilatation, decreased levels of blood inflammatory factors, reduced plaque on face area sections (22.57 ± 2.17) % vs (35.09 ± 2.38) % and cross sections (19.36 ± 1.85) % vs (25.53 ± 7.87) %, P ＜ 0.05, less macrophages (30.5 ± 2.79) % vs (41.34 ± 9.13) % T andlymphocytes infiltration (28.11 ± 4.24) % vs (35.79 ± 9.11) % in plaques and lower mRNA expressions of inflammatory factors (IL-6: 1.76 ± 0.50 vs 3.78 ± 1.15; TNF-α: 1.05 ± 0.30 vs 2.11 ± 0.48; ICAM-1: 1.96 ± 0.69 vs 2.71 ± 0.72; VCAM-1: 0.87 ± 0.21 vs 1.45±0.25; MCP-1: 1.34 ± 0.34 vs 1.77 ± 0.55) at aortic wall, P＜0.05.Conclusion: Irisin may improve atherosclerosis condition in ApoE-/-DM mice, the endothelial protection and antiinflammatory reaction were the important mechanisms. Irisin has the potential for preventing/treating atherosclerosis.

Irisin; Atherosclerosis; Diabetes mellitus

2014-10-21）

（编辑：漆利萍）

国家自然科学基金（81370896）

430070 湖北省武汉市，南方医科大学附属武汉临床学院（卢俊颜、向光大、梅稳）；广州军区武汉总医院 内分泌科（向光大、刘敏、向林、董靖）

卢俊颜 硕士研究生 研究方向：主要从事糖尿病血管并发症研究 Email:buyuelingyun@126.com 通讯作者：向光大

Email: Guangda64@hotmail.com

R541

A

1000-3614（2015）05-0492-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.05.019