正交试验优化水煎提取苜蓿枣芪总黄酮工艺

邓发星 祝芙蓉 李坤江 付美华 田晨欣(西北民族大学化工学院， 甘肃 兰州 7000)

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种高产优质的多年生豆科牧草,在世界许多国家广泛栽培,也是我国推广应用的主要牧草[1]。紫苜蓿含有大豆黄酮、皂苷、苜蓿酚、苜蓿素、瓜氨酸、糖等。紫花苜蓿具有品质好、产草量高、适口性好、营养丰富、易于家畜消化等特点,故有“牧草之王”美誉[2]。大枣(zizyphus jujuba dates)含有三帖酸、黄酮、环磷酸腺苷等。大枣既是普通食品，也是常用的药品，久食或入药膳，有补气血，益脾胃，通九窍，润肤养颜，延年养生之保健功效[3]。黄芪(Radix Astragali)是百姓经常食用的纯天然品，现代医学研究表明，黄芪有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用，能增强心肌收缩力，调节血糖含量，提高免疫功能，能够延缓细胞衰老的进程。

探究苜蓿、大枣、黄芪三种药食两用材料中的活性物质含量对制备保健食品有一定帮助，有望改善亚健康、提高身体免疫力。总黄酮在三种材料中是具有代表性的活性物质，所以探究苜蓿枣芪中总黄酮提取工艺是有意义的。

1 材料与仪器

1.1 材料

中性滤纸(型号102中速，杭州特种纸业有限公司)，95%乙醇(分析纯)，聚酰胺100目(层析柱用)，壳聚糖(医药级)，饮用水，苜蓿(采于西北民族大学化工学院)，黄芪(兰州复兴厚药材有限责任公司第一药庄)，大枣(兰州隆兴商贸有限公司)。

1.2 仪器

控温水浴锅(南通沪南科学仪器有限公司)，DHG—9245A型电热恒温鼓风干燥箱(上海—恒科学仪器有限公司)，干燥器，层析柱(泓宇仪器)，电子分析天平。

2 实验步骤与结果

2.1 实验前处理

称取苜蓿约7g，黄芪约9g，大枣约6g，精密称定。苜蓿截段，黄芪截段，大枣在150℃,45min进行干燥，大枣截段。

2.1.1 溶胀系数的测定

将三者混合物置于500ml圆底烧瓶中，量取200ml饮用水于圆底烧瓶中，冷浸24h,过滤，得滤液112.8ml，算得混合物共吸水87.2ml，即其溶胀系数为0.436。

2.1.2 水煎

将三者混合物置于500ml圆底烧瓶中，吸取适量饮用水置于圆底烧瓶中，冷浸45min，备用。

取备用物在一定条件下水煎。水煎后，冷却至室温，补齐其损失水分，将其过滤，备用。

2.1.3 聚酰胺实验中乙醇洗脱总黄酮用量选择

取备用原料在80℃、60min及料液比为1:6条件下水煎。分别设置三组实验，各加入40ml、45ml、50ml乙醇洗脱黄酮，经干燥失重法测得黄酮量依次为10mg、10.3mg、10.02mg。三者平均值为10.17mg,经计算RSD=1.5%,小于2%。即选取乙醇用量为40ml。

2.1.4 聚酰胺吸附实验

用量筒量取30ml滤液,加入约75mg壳聚糖，壳聚糖用于中药水提液的澄清主要与其吸附性能和絮凝作用有关[4]，微微加热使滤液中蛋白质充分沉淀，冷却至室温，补齐其损失水分，过滤，称量约0.3g聚酰胺上柱，量取适量乙醇过柱洗脱聚酰胺中醇溶性杂质，用量筒量取沉淀蛋白后的溶液10ml装柱，进行聚酰胺吸附黄酮实验，聚酰胺具有吸附黄酮的特性[5]，量取95%乙醇40ml洗脱总黄酮。

理论 · 实践2.1.5 干燥失重法测定总黄酮量及固化物量

使坩埚在105℃干燥至恒重，得重量m1。将洗脱的总黄酮置于坩埚中，用水蒸汽加热至乙醇完全挥发，坩埚放入烘箱105℃干燥，30min后取出置干燥器中放冷，然后称定重量，至恒重，得重量m2，即总黄酮量计算式为m2-m1。

固化物量测定依照黄酮量测定进行。

2.2 提取条件的选择

2.2.1 温度的选择

图1 温度对总黄酮提取量的影响

取备用混合物在60min、料液比为1∶7及温度分别为70℃、80℃、90℃条件下水煎。通过聚酰胺吸附实验得到70℃条件下黄酮量为72.65mg,80℃条件下黄酮量为133.47mg,90℃条件下黄酮量为115.53mg,如图1所示。由图1可得：总黄酮提取的最佳温度为80℃。

2.2.2 料液比的选择

取备用混合物在60min、80℃及料液比分别为1∶6、1∶7、1∶8条件下水煎。通过聚酰胺吸附实验得到1∶6条件下黄酮量为98.34mg,1∶7条件下黄酮量为133.47mg,1∶8条件下黄酮量为130.11mg,如图2所示。

图2 料液比对黄酮提取量的影响

由图2可得：总黄酮提取的最佳料液比为1∶7。

2.2.3 浸提时间和次数的选择

取备用混合物在料液比为1∶7、80℃及浸提时间分别为30min、60min、90min、120min条件下水煎。通过聚酰胺吸附实验得到30min条件下一煎黄酮量为86.45mg,二煎黄酮量为35.36mg；60min条件下一煎黄酮量为133.47mg,二煎黄酮量为91.25mg；90min条件下一煎黄酮量为129.32mg,二煎黄酮量为85.31mg；120min条件下一煎黄酮量为124.37mg,二煎黄酮量为82.57mg；如图3所示。

图3 浸提时间和次数对黄酮提取量的影响

由图3可得：总黄酮最佳的浸提时间为60min，由于二煎提取的总黄酮量趋势变化较一煎明显，即最佳浸提次数为2次。

2.3 正交试验因素水平设计及数据处理

通过单因素试验的分析，选取各因素中最佳条件附近试验点作为正交试验点，对各个试验结果进行误差分析，确定最佳提取黄酮工艺方案。本试验采用L9(34)正交表，以温度(A)、浸提时间(B)、料液比(C)作为三个因素，每个因素设计三个水平进行试验。

表1 水煎法提取黄酮正交试验因素与水平

针对表1所设计的正交试验因素与水平进行一煎提取试验，总黄酮提取结果见表2，总黄酮提取结果方差分析见表3，固化物结果见表4，固化物方差分析见表5。

表2 总黄酮提取结果

由表2极差结果分析得到，RC>RA>RB。三个因素对苜蓿枣芪中总黄酮提取的影响程度为：料液比(C)>温度(A)>浸提时间(B)。

表3 总黄酮提取结果方差分析

表3分析得到，试验所测得的F值均大于F0.05(2,2)=19.00，所以料液比、温度及浸提时间均具有显著性，在正交试验范围内，优化水煎苜蓿枣芪中总黄酮提取工艺为A3B3C3，即料液比为1∶7.5，温度85℃，浸提时间为75min。

通过对固化物结果极差分析得到，RC>RA>RB。三个因素对苜蓿枣芪中总黄酮提取的影响程度为：料液比(C)>温度(A)>浸提时间(B)。同时从固化物结果方差分析中得到，料液比(C)及温度(A)均具有显著性，与表3分析结果一致，证实总黄酮提取最佳工艺为A3B3C3是合理的。

表4 固化物结果

表5 固化物结果方差分析

2.4 正交最佳试验验证

在总黄酮提取最佳工艺为A3B3C3条件下进行3组平行验证实验，结果如表6所示。

表6 A3B3C3条件下一煎结果

由表6得：苜蓿大枣黄芪三种原料平均量为22.02mg，一煎总黄酮平均量为197.12mg及其收率为0.90%，一煎固化物量为3881.32mg及其收率为17.63%。

2.5 结果

实验选定水煎浸提次数为2次，由正交验证实验中各数据进行二煎后结果如表7所示。

表7 A3B3C3条件下二煎结果

结合A3B3C3条件下在煎煮2次后，所得到3组苜蓿枣黄芪平均量为22.02g，总黄酮平均量为283.10mg及其收率为1.29%；固化物平均量为6521.45mg及其收率为29.62%。

3 结语

(1)本实验采用正交试验法选取苜蓿枣芪中总黄酮最佳提取工艺条件：温度为85℃、料液比为1∶7.5、浸提时间为75min、浸提次数为2次，得到总黄酮收率为1.29%，固化物收率为29.62%。

(2)水煎法是中药传统提取方法，结合单因素试验法和正交试验法探究影响总黄酮提取的因素，采用聚酰胺吸附法和重量法测定总黄酮量。方法简单易行。

(3)试验中采用壳聚糖作为絮凝剂，除去提取液中的蛋白质及鞣质等杂质。壳聚糖以其成本低，具有良好的生物学可溶性，又能保留有效成分等特点，被广泛应用于中药药液的精制[6]。

(4)重量法要求对实验者有较高操作能力，由此也会造成一定误差。

[1,2]朱见明，李娜，张亚军,等.苜蓿黄酮的研究进展[J].草业科学，2009,26(9)：156.

[3]王蓉珍，赵子青，林勤保,等.大枣功效成分检测的研究进展[J].食品工业科技，2012,33(4)：423.

[4]张彤，徐连英，蔡贞贞.壳聚糖澄清剂精制中药水提液的应用前景[J].中国中药杂志，2001,26(8)：517.

[5]张中建，阎小伟.聚酰胺吸附法测定总黄酮[J].分析检测，2002,23(10)：81.

[6]孙星，盛华刚，张超，等.壳聚糖絮凝沉降法对葛根芩连汤中黄酮和生物碱成分的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012,18(20)：15.