基于分子及传统方法对九龙山自然保护区黑麂资源研究

季国华，郑伟成*，王 华，刘菊莲，潘成椿，叶飞英

（1. 浙江九龙山国家级自然保护区管理局，浙江 遂昌 323300；2. 浙江师范大学 生态研究所，浙江 金华 321004）

基于分子及传统方法对九龙山自然保护区黑麂资源研究

季国华1，郑伟成1*，王 华2，刘菊莲1，潘成椿1，叶飞英1

（1. 浙江九龙山国家级自然保护区管理局，浙江 遂昌 323300；2. 浙江师范大学 生态研究所，浙江 金华 321004）

2012年10月和2013年5月，采用分层—样地—样带抽样统计法分别对九龙山自然保护区的核心区、缓冲区和实验区所设置的15条样带进行黑麂（Muntiacus crinifrons）资源调查，结合样带法、红外相机技术法以及分子标记法对九龙山保护区黑麂的种群密度及保护现状进行了调查。结果表明：保护区内的黑麂种群平均密度为7.93 ±0.75只/km2，其中核心区、缓冲区、实验区黑麂种群密度分别为10.27±1.17、7.58±0.26、4.89±1.28只/km2；通过方差分析，不同样地间黑麂种群密度差异极显著（F = 10.45 > F3,26= 4.64，P < 0.01）。这表时，黑麂在九龙山保护区内广泛分布，而主要集中分布在上寮坑、岩坪一带，黄基坪等周边地带为黑麂的次要分布区，其余地区为一般分布区。

黑麂种群密度；样带法；红外相机法；分子标记法

黑麂（Muntiacus crinifrons），也称红头麂、乌金麂、红头青麂、蓬头麂、乌獐，为典型的亚热带山地森林动物，国家一级保护动物，隶属偶蹄目（Artiodactyla）鹿科（Cervidae）麂属（Muntiacus），在濒危野生动植物物种国际贸易公约（CIES）和国际自然与自然资源保护联盟（IUCN）名录中分别被列入附录Ⅰ和易危（Vulnerable，VU）级[1]。现存种群主要分布于浙江、安徽、江西和福建四省[2～3]。

在野外很难见到活的黑麂个体和获得黑麂的肌肉组织进行分子水平的分析，但可以通过非损伤性取样（noninvasive sampling）[4]，获得黑麂的粪便[5]、毛发[6]等进行相关研究。程宏毅等[7～10]成功从黑麂的粪便中提取出DNA及其PCR检测，为从分子水平研究黑麂提供了技术基础。周襄武等[11～12]从黑麂的粪便中提取DNA，并扩增线粒体DNA细胞色素b基因和 2个微卫星位点进行检测，同时提取黑麂肌肉和皮毛样品的DNA作对照，结果表明，该方法可以从粪便中提取高质量的黑麂DNA，并可进行有效扩增。刘军[13]通过对黑麂粪便的研究，对黑麂进行个体识别和性别鉴定。因此，以黑麂粪便作为样本对黑麂的数量进行研究是可行的。

红外线触发自动数码相机陷阱技术（infrared triggered cameras technology，ITCT），以下简称红外相机技术，是一项定性和定量相结合的调查技术，具有昼夜连续工作、调查成本低、无创伤、环境干扰小、抗环境变化以及能获得高度隐蔽物种和地形复杂区域的信息等优点[14～15]。对于保护区来说，监测是为了掌握资源和生物多样性变化的趋势，并且监测需要获得长时间可比较的数据。

黑麂在九龙山的分布呈现出分布广，数量多，种群密度高的特点，九龙山保护区及周边区域已经成为我国黑麂最重要的分布中心和最大黑麂种群的集中分布区。本次调查九龙山保护区黑麂的资源，有利于掌握近10 a来黑麂种群数量的变化，以评估对黑麂保护的成效，也为今后保护对策和措施的制定和实施提供科学依据。

1 研究区自然概括

九龙山国家级自然保护区位于浙江省遂昌县西南部，地处浙、闽、赣三省交界处（118° 49′ ～ 118° 55′ E，28° 19′ ～ 28° 24′ N），为武夷山系仙霞岭山脉的一个主要分支，是钱塘江水系的最南端源头[1]。九龙山山地陡峭，高峰群集。保护区内山体坡度 > 40°的面积约占总面积的80%。九龙山自然保护区属中亚热带湿润季风区，一年中气候有明显的季节性变化，气候呈现明显的垂直地带性。降水量大，平均年降水量在1 500 ～ 2 000 mm，主要集中在4-6月，占全年降水的46%，7-8月为少雨期[16]。植被类型主要分为针叶林、针阔混交林、阔叶林、竹林和灌丛[17]。保护区优良的森林生态环境，为野生动物的栖息、繁衍提供了良好的条件。九龙山保护区是国家一级保护动物、中国特有的世界性受胁物种黑麂最重要的分布中心和最大野生种群的集中分布区。

2 调查方法

通过广泛收集和查阅以往有关黑麂的文献作为基础资料，于2011年11月至2013年8月，在九龙山国家级自然保护区开展黑麂资源的调查。

2.1 样带（样方）法

2012年10月和2013年5月，采用国内外常用的分层—样地—样带抽样统计法[18]，分别对九龙山自然保护区的核心区、缓冲区和实验区所设置的15条样带进行调查。样带设置以保护区内4个保护站为样地，遵守随机等概率原则，向外呈辐射状进行布置，与2002年至2003年调查所设的样带一致[1]以便对比分析。黄坛淤2条代表实验区（样带长度为（3 000、3500 m）；黄基坪4 条代表缓冲区（3 000、3 500、3 500、4 000 m），上寮坑5条（3 000、3 500、4 000、5 000、5 000 m）、岩坪4条（3 500、4 000、4 000、5 000 m）代表核心区，样带单侧宽度为20 m。

调查样带两侧各20 m范围内及样方内的黑麂活动的新鲜痕迹（如足迹、卧迹、洞穴、粪便、食物残迹、叫声等），记录生境类型，用GPS进行定位。2.2 红外相机法

于2011年11月至2013年8月，在九龙山国家自然保护区的不同区域布置了32台红外相机进行监测。在相机的布置过程中主要采取随机型和海拔垂直型放置模式，部分区域采取十字型模式[19]（表1）。

表1 九龙山红外相机摆放模式Table 1 Camera trap placement patterns in Jiulongshan Nature Reserve

红外相机在各个区域内均沿所设定的样地进行摆置，红外相机均放置在样地内，相邻红外相机的距离保持在500 m左右。样地大小的设定原则是同一样地内红外相机间距离最大的设为样地的长，确定样地长度后，以横向相机间最大距离为样地宽度。红外相机在样地内的放置沿黑麂常出没的路线及足迹链丰富的生境放置。所放置红外相机样地的大小在不同区域布置相机时用GPS仪表同时记录每台相机所在位置的海拔、坡度、坡向、经纬度等生态因子。

2.3 DNA指纹技术

2.3.1 实验材料 除了在样带（样方）法调查过程中收集黑麂粪便外，在内北坪、黄基坪和黄坛坞分别设置样方（表2），2012年10月和2013年5月各收集1次。收集时，仔细搜寻样方内的黑麂新鲜粪便，当发现黑麂新鲜粪便时，采集部分粪便，现场装入盛有无水乙醇的带盖密封塑料瓶中，带回实验室便将其放入-20℃冰箱中保存；采集时均使用一次性手套或者灭菌容器和材料以防止采样过程中的人为污染和样品间的交叉污染，并及时标注、记录样品的采集时间、采集地名、海拔高度和经纬度，以及采集者姓名等详细资料。

2.3.2 实验处理 将从九龙山保护区内采集的黑麂粪便样本带回实验室，放入冰箱中-20℃保存备用。将采集的粪便样本进行粪便DNA提取，然后进行PCR扩增，将PCR产物送上海生工进行检测，获得数据后用相关软件进行分析。粪便DNA的提取及PCR用刘军[21]的方法。

表2 各样地黑麂粪便的采集Table 2 Feces collected in sample plots

2.4 数据处理

2.4.1 样带（样方）法 依据前期发现黑麂实体与活动痕迹的关系，确定出黑麂活动痕迹（足迹、粪便和拱痕等）与个体数之间的关系，即黑麂足迹链和拱痕间隔500m以上的按2个个体计算，500m以内的按1个个体计算，依次类推，累加黑麂的密度得到总的密度。

样带（样方）内种群密度计算公式[20]：

式中，i代表各样带（样方），j代表各生境，Di为i样带（样方）中黑麂的密度（只/km2），Nij为i样带（样方）中第j种生境累计单位时间内黑麂痕迹总数，Aij为样带（样方）中第i种生境的调查面积（km2），t为单位时间（7 d），以足迹为指标时，根据足迹大小排除重复ε为1；以粪便为指标时，需要用排便率对数据进行修正，ε即为日排便率（堆/d）。区间估计[22]为

求得九龙山保护区内的黑麂种群密度后，密度乘以黑麂的栖息环境面积即为黑麂的种群数量。

2.4.2 红外相机数据处理 在对2012年10月至2013年5月的相片整理后，得到黑麂的独立相片（independent photograph，IP）共468张。对地点或时间相近连续拍摄的物种照片采用相同侧面、部位的斑纹、体型、毛色等特征进行比对，以判断是否属同一次数，不同次数的照片定义为独立照片。识别在ACD see 15软件的辅助下进行。

红外相机黑麂的日拍摄频率计算公式：

其中：IP为独立相片数（张），IPij为样地i中j相机的独立相片数（张）；T为红外相机2012年10月放置至2013年5月红外相机数据收回经历的时间，每月按30 d进行计算。

2.4.3 DNA指纹技术数据处理 根据所采集粪便的面积计算出黑麂的种群密度，然后算出整个保护区内的黑麂种群数量。用软件Cervus3.0[22]分析微卫星数据，对粪便样本进行个体识别，确定黑麂的个数。基于非损伤性标志重捕法统计种群数量，根据个体识别的数据，即不同地点的同一个体数据，其中任何一次可记为标志，其他记录可看作该个体的重捕。数量分析使用软件Capwire[24～25]完成。软件有两种模型：ECM（even capture probability model）和TIRM（two innate rates model）。ECM模型的基本假设是种群中每个个体的排便率基本一致，对每个个体的抽样强度也基本一致，因此每个个体被捕获的概率一致，即种群数量N的倒数 1/N。TIRM模型的基本假设是种群中个体间被捕获的概率相差很大，在模型拟合时按照捕捉的概率将个体分成捕捉困难（B）和容易捕捉

（A）两大类。

3 结果与分析

3.1 样带（样方）法调查结果与分析

3.1.1 不同功能区黑麂种群密度 通过调查统计，其结果见表 3。不同样地的黑麂种群密度变化较大，反应出黑麂的分布是不均匀的。其中上寮坑样地密度最高，为10.70±1.58只/km2；黄坛淤样地密度最小，为4.89±1.28 只/km2；黄基坪和岩坪样地密度居中，分别为7.58±0.26只/km2、9.83±0.76只/km2，全区密度平均为8.48±0.75 只/km2。

表3 各样地黑麂的种群密度Table 3 Population density of M. crinifrons in investigated sample plots

本次调查区域涵盖九龙山保护区内的核心区、缓冲区和实验区。其中上寮坑和岩坪为核心区；黄基坪为缓冲区；黄坛淤为实验区。由于核心区、缓冲区和实验区的栖息地生境状况、人为干扰程度以及保护力度等存在差别，黑麂在各区的分布并不是均匀的。核心区、缓冲区、实验区黑麂种群密度分别为10.27±1.17、7.58±0.26、4.89±1.28只/km2。

有关研究表明，生境质量对鹿科动物种群密度的波动起着重要的作用[25-27]。从以上结果可以看出，黑麂更喜欢选择在栖息地质量优越的核心区地带活动，在缓冲区内黑麂种群密度也维持在比较高的水平，而在实验区则较少。除了黑麂喜欢栖息于高海拔外，各功能区的生境差异是导致黑麂在九龙山保护区内分布不均匀的主要因素。

3.1.2 不同样地间黑麂种群密度的差异 计算4个样地中黑麂种群密度及方差，并检验不同样地间种群密度的差异。通过方差分析，不同样地间黑麂种群密度差异极显著（F = 10.45 > F3,26= 4.64，P < 0.01），种群密度最低的黄坛淤样地（4.89±1.28）与处于核心区内的上寮坑和岩坪样地均存在极显著差异（P < 0.01），与黄基坪样地存在显著差异（P < 0.05）。上寮坑、黄基坪、岩坪三个样地间的种群密度存在显著差异（F = 5.07 > F2,21= 3.47，0.01 < P < 0.05），上寮坑、岩坪样地的密度高于黄基坪样地。从以上结果可以看出，黑麂在九龙山保护区内广泛分布，而主要集中分布在上寮坑、岩坪一带，黄基坪等周边地带为黑麂的次要分布区，其余地区为一般分布区。

本次调查结果与2002年至2003年的调查结果[1]相比，各样地黑麂种群密度均有增加，黄坛淤、上寮坑、岩坪和黄基坪4个样地分别增加了1.68、1.96、1.75和1.33只/km2，全区黑麂密度为8.48±0.75只/km2，全区面积为55.25 km2，黑麂数量为469±41只，资源量有所增加。

3.2 红外相机调查结果与分析

对红外相机所获得的数据进行整理分析，结果见表4。全区域黑麂的日拍摄率为2.08次/d，其中核心区黑麂的日拍摄率最高，为1.68次/d，其中七树坑样地日拍摄率居核心区首位，达0.69 次/d；缓冲区的黄基坪日拍摄率最低，为0.10次/d；实验区为0.3次/d。通过不同区域的日拍摄率，可以大致看出核心区的黑麂密度比缓冲区及实验区明显要高。但此次发现作为缓冲区的黄基坪日拍摄率反而比实验区的黄坛坞要低。原因可能是因黄基坪所设置样地小，相机布置量少造成的。红外相机的日拍摄率能大致对不同区域黑麂密度进行对比，但由于受到样地选择，相机摆放方式等因素影响，只能作为密度大小判断的一个依据，具体黑麂密度应结合样地法和DNA指纹技术进行调查计算。

表4 九龙山国家自然保护区不同区域红外相机捕捉的黑麂日拍摄频率Table 4 Capture rate of M. crinifrons in different sample plots

3.3 DNA指纹技术调查结果与分析

DNA指纹技术调查结果见表5，得出的内北坪、黄基坪和黄坛坞样地的平均密度分别代表核心区、缓冲区和实验区的密度，全区黑麂资源量为492只。

表5 DNA 指纹技术调查的黑麂数量Table 5 Numbers of M. crinifrons obtained by DNA

样带（样线）法估算出黑麂资源量为469±41只，DNA指纹技术法结果显示保护区内的黑麂资源量为492只。综合以上黑麂数量的调查方法，九龙山自然保护区内的黑麂资源为420～520只。

4 黑麂的资源评价与保护

1999-2000年，浙江省黑麂专项调查显示，浙江省黑麂资源总量为3 500 ～ 4 000只[3]；2002-2003年，郑祥等[1]对九龙山保护区内黑麂资源调查，全区黑麂种群平均密度为7.32±0.69只/km2，为404±38只；2012-2013年，对黑麂资源调查显示，九龙山保护区内的黑麂种群平均密度为7.93±0.75只/km2，数量为420 ～ 520只。本次调查结果与以往相比，九龙山保护区内黑麂的数量在增加，说明九龙山栖息环境利于黑麂的生存和繁殖，九龙山保护区对黑麂的保护工作是卓有成效的。

为了更好地发挥自然保护区的作用，对九龙山黑麂资源的保护提出以下建议：

（1）开展常规化的黑麂种群数量动态监测。建议每5 a复查一次，有利于掌握黑麂种群数量的变化规律，以制定和调整相应的保护对策和措施。

（2）加强对保护区黑麂栖息环境质量的监测。主要包括黑麂的食物（种类、可利用量、质量）、隐蔽所（类型、数量和质量）等变化特征，以确定保护区内黑麂的环境容纳量。

（3）加强对保护区的管理和对黑麂保护的宣传。保护区在开展保护、监测、减灾等工作的同时，可以采用标语、警示牌、制作和播放黑麂宣传保护视频等多种形式，加强对周边地区居民及过往人员的宣传教育，使其能主动参与黑麂的保护工作。如果发现受伤的黑麂，要及时进行救护。加强与当地政府的协调和合作，对保护区外围的山林采取相应的保护措施，以扩大黑麂的生存空间。

（4）开展黑麂的人工养殖。在自然保护区的实验区，可以考虑建立以黑麂为主的珍稀动物养殖场。既可以收养没收、误伤、误捕的珍稀野生动物，又可以开展黑麂等珍稀动物的生物学研究，驯养和繁殖人工种群，为珍稀动物的就地保护和异地保护以及资源利用开拓新的途径。

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Investigation on Distribution of Muntiacus crinifrons in Jiulongshan National Nature Reserve

JI Guo-hua1，ZHENG Wei-cheng1*，WANG Hua1，LIU Ju-lian1，PAN Cheng-chun1，YE Fei-ying1
(1. Jiulongshan National Nature Reserve Administration of Zhejiang, Suichang 323300, China; 2. School of Ecology, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China)

Investigations on Muntiacus crinifrons resources were conducted from October 2012 to May 2013, by stratified sampling method at 15 transects in the core zone, buffer zone, and experimental zone of Jiulongshan National Nature Reserve of Zhejiang, combined with infrared triggered cameras technology(ITCT) and molecular makers. The result showed that the average density of M. crinifrons was 7.93±0.75/km2in the Jiulongshan, 10.27±1.17/km2in core zone, 7.58±0.26/km2in buffer zone and 4.89±1.28/km2in experimental zone. Analysis of variance demonstrated that there was significant difference among sample plots （F =1 0.45 > F3,26= 4.64，P < 0.01）. The investigation resulted that M. crinifrons distributed widely in Jiulongshan National Nature Reserve.

Muntiacus crinifrons; population density; transect method; infrared triggered camera technology; molecular marker

S718.6

A

1001-3776（2015）04-0001-06

2014-10-12；

：2015-03-20

林业国家级自然保护区中央财政补助资金（浙财农字〔2010〕174号）

季国华（1978-），男，浙江遂昌人，助理工程师，从事自然资源保护工作；*通讯作者。