扩增阻滞突变系统快速检测H型高血压患者MTHFRC677T基因型的应用研究

·论著·

扩增阻滞突变系统快速检测H型高血压患者MTHFR C677T基因型的应用研究

王佳，王淑玲，周文胜，洪秀琴

作者单位：410016湖南省长沙市，湖南省老年医院 湖南省老年医学研究所(王佳，王淑玲，周文胜，洪秀琴)；中南大学基础医学院(王佳)，公共卫生学院(洪秀琴)

通信作者：周文胜，410016湖南省长沙市，湖南省老年医院 湖南省老年医学研究所；E-mail：zhouwensheng@163.com

洪秀琴，410000湖南省长沙市，湖南省老年医院 湖南省老年医学研究所,中南大学公共卫生学院；E-mail：hldhld@126.com

【摘要】目的 通过扩增阻滞突变系统-聚合酶链反应(ARMS-PCR)检测H型高血压患者5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T基因型，以期建立一种低成本、简单快速的MTHFR C677T基因分型方法。方法基于湖南省H型高血压危险因素研究的大型流行病调查的人群基础，采用单纯随机方法，选取94例H型高血压患者作为研究对象。设计阻滞度递减的系列错配引物，采用ARMS-PCR对94例患者外周血样本的MTHFR C677T基因型进行鉴定，并抽取不同基因型进行测序验证。结果ARMS-PCR产物电泳后条带清晰，易于判读MTHFR C677T基因型。94例H型高血压患者共检出CC基因型42例、CT基因型24例和TT基因型28例。ARMS-PCR与DNA测序结果一致。结论ARMS-PCR经阻滞度递减的系列错配引物能有效对MTHFR C677T基因型进行鉴定，此法具有成本低、操作简单、用时短的优点。适用于各类基因的多态性分析。

【关键词】扩增阻滞突变系统；5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶；基因分型；H型高血压

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81202281)；湖南省科技计划项目(2014FJ3035)

【中图分类号】R 544.1R-33

收稿日期：(2015-08-28；修回日期：2015-10-18)

王佳，王淑玲，周文胜，等.扩增阻滞突变系统快速检测H型高血压患者MTHFR C677T基因型的应用研究[J].中国全科医学，2015，18(35)：4303-4306.[www.chinagp.net]

Rapid Detection of MTHFR C677T Genotype in H-type Hypertension Patients by Amplification Refractory Mutation SystemWANGJia，WANGShu-ling，ZHOUWen-sheng，etal.HunanInstituteofGerontology，HunanGeriatricHospital，Changsha410016，China

Abstract【】ObjectiveTo develop a cost-effective，rapid and simple method for MTHFR C677T genotyping by amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction(ARMS-PCR)on H-type hypertension patients.MethodsFrom the population sampled by the large epidemiological investigation based on the research of risk factors for H-type hypertension in Hunan Province，94 H-type hypertension patients were taken as subjects using simple random method.A series of mismatched-primers of refractory reduced were designed，and ARMS-PCR was employed to identify the MTHFR C677T genotypes of peripheral blood samples of the 94 patients，and different genotypes were abstracted for sequencing validation.ResultsThe bands of ARMS-PCR product agarose gel electrophoretogram were clear sufficiently to identify genotype.Among the 94 H-type hypertension patients 42 were CC genotype，24 were CT genotype and 28 were TT genotype.ARMS-PCR results were in complete accord with DNA sequencing.ConclusionARMS-PCR is a low-cost，simple and time-saving method for the determination of MTHFR C677T genotype by mismatched-primers of refractory reduced.The approach can be used to detect other gene polymorphism.

【Key words】Amplification refractory mutation system；5，10-methylenetetrahydrofolate reductase；Genotyping；H-type hypertension

伴有高血浆同型半胱氨酸(Hcy)血症(一般指Hcy≥15 μmol/L)的高血压，称为H型高血压[1]。有数据显示，目前我国30岁及以上人群中有3.3亿为高血压患者，而其中75%伴有血浆Hcy水平升高。越来越多的研究表明，高血浆Hcy血症和高血压在导致心脑血管事件上存在协同作用，Hcy增高合并高血压的心脑血管风险升高10.3倍[2-3]。遗传和环境是影响Hcy水平的最主要因素。其中5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是Hcy代谢过程中的关键代谢酶，该酶基因易发生667C→T突变，导致酶的活性降低，Hcy代谢异常，进而引起高血浆Hcy血症。因此，进行MTHFR C677T基因的多态性检测，预测H型高血压患病的易感人群，对预防H型高血压的发生具有重有意义。故而一种快速而简便的MTHFR C677T基因分型法对任何一个参与H型高血压临床研究的实验室而言都是必需的。本研究旨在探讨扩增阻滞突变系统检测H型高血压患者MTHFR C677T基因型的准确性。

1对象与方法

1.1研究对象基于湖南省H型高血压危险因素研究的大型流行病调查的人群基础[4]，采用单纯随机方法，选取94例H型高血压患者作为研究对象。

1.2主要仪器和试剂聚合酶链反应(PCR)扩增仪为美国BIO-RAD公司产品；电泳仪为天能公司产品；化学发光成像仪为美国GE公司ImageQuant LAS 500；核酸蛋白定量检测仪为美国BIO-RAD公司产品；血液基因组DNA小量抽提试剂盒购自北京康为世纪生物有限公司；Takara Taq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司；ARMS-PCR引物由北京六合华大基因公司合成。

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1.3方法

1.3.1人外周血白细胞提取DNA采集3～5 ml清晨空腹外周静脉血，取EDTA抗凝血300 μl，使用北京天根生化血液基因组DNA小量抽提试剂盒法提取DNA，具体步骤按说明书进行操作，其中离心过程均采用水平离心机，以10 000 r/min离心1 min，离心半径8 cm。使用BIO-RAD核酸蛋白定量检测仪测定所提取DNA在260 nm和280 nm处的吸光度，计算其纯度和浓度，以灭菌蒸馏水调整终浓度为20 mg/L。样本分装后于-20 ℃保存备用。

1.3.2引物设计MTHFR C677T是一种不规范的HGVS Names标注SNP位置，GenBank对MTHFR C667T的refSNP ID为rs1801133。本研究在NCBI的SNP数据库中查找rs1801133的参考核酸序列号NG_013351，据此序列设计了MTHFR C677T的阻滞度递减的系列错配引物(见表1)，其中上游引物3′端固定地终止于MTHFR C677T的突变位点，并且为了提高引物的特异性，在上游引物3′端倒数第3、4位引入错配碱基。

1.3.3采用ARMS-PCR方法对MTHFR C677T进行基因分型首先以错配后阻滞度最高因而扩增差异性最显著的F11/R和F12/R引物对进行扩增。每个基因组DNA样品平行建立C、T两个反应体系：C反应中加入F11/R引物对，T反应中加入F12/R引物对。通过引物退火温度、模板浓度和反应循环数对PCR反应条件进行优化，确定最佳PCR反应体系为：10×buffer 2.5 μl，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)2 μl，Takara Taq(5 U/μl)0.125 μl，F11/R和F12/R(10 μmol/L)0.625 μl，R(10 μmol/L)0.625 μl，模板DNA(20 ng/μl)2.5 μl，ddH2O 16.625 μl，共25 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，53.8 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共进行34个循环，最后72 ℃保温5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，采用美国GE化学发光成像仪摄片。实验过程中，对电泳检测表现为双泳道阴性结果的样本，依次换用阻滞度下降的引物对(F21/R和F22/R、F31/R和F32/R)再行扩增。

表1阻滞度递减的MTHFR C677T等位基因分型ARMS-PCR系列引物

Table 1A series of ARMS-PCR mismatched-primers of refractory reduced for MTHFR C677T genotyping

引物名称引物序列F11(等位基因特异性上游引物1)5'-AGAAGGTGTCTGCGGttGC-3'F12(等位基因特异性上游引物2)5'-AGAAGGTGTCTGCGGttGT-3'F21(等位基因特异性上游引物1)5'-AGAAGGTGTCTGCGGGtGC-3'F22(等位基因特异性上游引物2)5'-AGAAGGTGTCTGCGGGtGT-3'F31(等位基因特异性上游引物1)5'-AGAAGGTGTCTGCGGtAGC-3'F32(等位基因特异性上游引物2)5'-AGAAGGTGTCTGCGGtAGT-3'R(等位基因特异性共用下游引物)5'-GAAACACTGATTTAAGCAGGATTTG-3'

注：下划线所示碱基为SNP位点碱基，C为野生型，T为突变型；小写字母表示引入的错配碱基及位置

1.3.4PCR产物基因测序单纯随机选取不同基因型的PCR产物(各15例)，送至北京六合华大基因公司测序分析，验证电泳结果。

2结果

2.1MTHFR C677T的ARMS-PCR基因分型结果分型标准：C反应体系是对MTHFR C677T基因C等位基因的扩增，T反应体系是对MTHFR C677T基因T等位基因的扩增。在两个反应体系中如果只有C反应体系扩增到425 bp产物，即为MTHFR C677T基因野生CC型；若两个反应体系均扩增到425 bp产物，即为MTHFR C677T基因杂合突变CT型；若只有T反应体系扩增到425 bp产物，即为MTHFR C677T基因纯合突变TT型。

首先以错配后阻滞度最高因而扩增差异性最显著的F11/R和F12/R(见图1A)引物对进行扩增，然后对电泳检测表现为双泳道阴性结果的标本，依次换用阻滞度下降的引物对F21/R和F22/R(见图1B)、F31/R和F32/R(见图1C)再行扩增。据此检测方法，94例H型高血压患者共检出野生CC基因型42例，杂合突变CT基因型24例和纯合突变TT基因型28例。

2.2PCR产物碱基序列测序结果随机选取不同基因型的PCR产物(各15例)经基因测序分析显示均与ARMS-PCR分型结果相一致(见图2)。

注：M=DL2 000 DNA Marker；A=F11/R和F12/R扩增结果；B=F21/R和F22/R扩增结果；C=F31/R和F32/R扩增结果；1、4、5和7=野生CC基因型；3=杂合突变CT基因型；2和6=纯合突变TT基因型

图1ARMS-PCR方法检测MTHFR C677T基因多态性分型电泳图

Figure 1Electrophoretogram of MTHFR C677T genotyping by ARMS-PCR

注： ↑所示突变位点；A=野生CC基因型，B=杂合突变CT基因型，C=纯合突变TT基因型

图2PCR产物碱基测序图

Figure 2Sequencing of the PCR products base

3讨论

DNA测序显然是MTHFR C677T基因分型最准确的检测方法，但一般也需先对样本行普通PCR后再送去生物技术公司进行测序，如果样本量大，成本则比较高。临床与基础实验室受设备的限制，大多采用聚合酶式反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行MTHFR C677T基因多态性测定，该方法需经历PCR扩增、HinfI限制性内切酶消化、琼脂糖电泳等步骤。耗时、成本高、操作复杂，还有可能存在酶切不充分等现象。

ARMS-PCR又称等位基因特异性扩增，是以Taq DNA聚合酶缺少3′-5′外切酶活性，不能修复扩增时引物3′末端单个碱基的错配为基础，引物的3′端碱基与位点等位基因互补时，则继续扩增；当引物3′端碱基与位点等位基因错配时，则扩增停止或者是效率严重下降。ARMS-PCR与PCR-RFLP的分型方法相比，因不需要对PCR产物进行酶切消化，减少了限制性内切酶的使用以及实验操作环节，因此，明显节约了时间(一般只需3 h)，降低了成本，提高了效率。

引物设计是ARMS-PCR反应中最主要环节。为了增加扩增特异性，提高检测精准性，本研究通过在MTHFR C677T上游引物3′末端的第3、4位碱基位点上引入错配碱基，设计了F11/R和F12/R、F21/R和F22/R、F31/R和F32/R退火难度(阻滞度)递减的系列错配引物，从而可不断纠正涉及引物结合范围内的模板DNA差异导致的引物退火难度的增加。有研究同样证实在特异引物第4位碱基处引入错配在某些条件下比在第2位或第3位引入错配的特异性强，并且发现对于个别引物而言，在第3位和第4位同时引入2个错配碱基比仅在第 2位或第3位引入错配的特异性强[5-6]。本实验过程中，首先用错配后阻滞度最高因而扩增差异性最显著的F11和F12引物对进行扩增，然后用对电泳检测表现为双泳道阴性结果的标本，依次换用阻滞度下降的引物对再行扩增，这些标本也逐次获得了理想的分型结果。

许多研究表明[7-8]，MTHFR C677T纯合突变TT基因型携带者患H型高血压风险升高。所以，对人群进行MTHFR C677T基因的多态性快速检测，预测H型高血压患病的易患人群，对预防H型高血压的发生具有重要意义。理论上，只要设计好ARMS-PCR阻滞度递减的系列错配引物，ARMS-PCR适用于各类基因的多态性分析。

本文价值：

本研究通过设计阻滞度递减的系列错配引物，采用ARMS-PCR对H型高血压患者外周血样本的MTHFR C677T基因型进行鉴定。大量研究表明，MTHFR C677T基因中TT基因型突变对H型高血压的高发病风险有显著贡献，因此，建立一种快速而低成本的检测MTHFR C677T基因型的分型方法对任何一个参与H型高血压临床研究的实验室而言都是必需的，并且该法简便易行，可操作性强，对临床可能有较大的帮助。

参考文献

[1]Hu DY，Xu XP.Prevention of stroke relies on valid control "H" type hypertension[J].Chinese Journal of Internal Medicine，2008，47(12)：976-977.(in Chinese)

胡大一，徐希平.有效控制“H型”高血压——预防卒中的新思路[J].中华内科杂志，2008，47(12)：976-977.

[2]Zhang Y，Huo Y.Hypertension with elevated homocysteine——H type hypertension[J].Advances in Cardiovascular Diseases，2011，32(1)： 3-6.(in Chinese)

张岩，霍勇.伴同型半胱氨酸升高的高血压——“H型”高血压[J].心血管病学进展，2011，32(1)：3-6.

[3]El-Khairy L，Ueland PM，Refsum H，et al.Plasma total cysteine as a risk factor for vascular disease：The European Concerted Action Project[J].Circulation，2001，103(21)：2544-2549.

[4]洪秀琴.H型高血压的危险因素研究[D].长沙：中南大学，2015.

[5]Hou YP，Luo QQ，Chen CJ，et al.Application of tetra primer ARMS-PCR approach for detection of Fusarium graminearum genotypes with resistance to carbendazim[J].Australasian Plant Pathology，2013，42(1)：73-78.

[6]Wang F，Zhao CL，Wu R，et al.Establishment of ARMS-PCR genotyping method for identification of ovine PRNP alleles at codon position 136，154 and 171[J].Chinese Veterinary Science，2013，43(2)：118-125.(in Chinese)

王芳，赵春林，吴润，等.绵羊PRNP密码子136和154及171等位基因型的ARMS-PCR鉴定方法的建立[J].中国兽医科学，2013，43(2)：118-125.

[7]Zong YH，Xu XP，Huo Y，et al.Genetic and environmental factors for H-type hypertension in Anqing rural community[J].Chinese Journal of Hypertension，2011，19(5)：445-449.(in Chinese)

宗永华，徐希平，霍勇，等.影响安庆农村地区H型高血压发生的遗传和环境因素[J].中华高血压杂志，2011，19(5)：445-449.

[8]翟秀伟.昆明地区汉族人群MTHFR C677T基因多态性与高血压病的相关性研究[D].昆明：昆明医科大学，2014.

(本文编辑：贾萌萌)