不同血瘀证亚型对小鼠移植瘤及肺转移灶4T1细胞迁移及侵袭能力的影响

路晨雯郭 勇

·论著·

不同血瘀证亚型对小鼠移植瘤及肺转移灶4T1细胞迁移及侵袭能力的影响

路晨雯1郭 勇2

目的观察不同血瘀证亚型Balb/c小鼠移植瘤及肺转移灶4T1细胞的迁移及侵袭能力。方法 将9只雌性8周龄Balb/c小鼠随机分为单纯荷瘤组、寒凝血瘀荷瘤组、热毒血瘀荷瘤组，每组3只，分别造模。造模第43天处死小鼠，无菌条件下取移植瘤及肺转移灶组织，通过细胞划痕试验、Transwell迁移及侵袭试验分别检测不同血瘀证亚型移植瘤及肺转移灶中4T1细胞迁移及侵袭能力。同一证型造模组中移植瘤与肺转移灶间采用t检验比较差异，同种组织来源部位（移植瘤或肺转移灶）中三组证型造模组间采用方差分析比较差异。结果单纯荷瘤组、寒凝血瘀荷瘤组、热毒血瘀荷瘤组中，移植瘤与肺转移灶的4T1细胞细胞划痕试验结果依次为（47.5±19.8）μm比（215.8± 145.7）μm、（59.0±8.5）μm比（577.3±70.5）μm、（118.8±15.2）μm比（663.4±23.8）μm，除单纯荷瘤组外寒凝血瘀荷瘤组、热毒血瘀荷瘤组肺转移灶细胞迁移距离均大于移植瘤（P＜0.05）；Transwell迁移试验结果为（13.5±8.4）个/视野比（25.9±12.8）个/视野、（17.5±3.8）个/视野比（49.0±9.7）个/视野、（38.5± 11.3）个/视野比（65.8±31.2）个/视野，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Transwell侵袭试验结果为（15.8±5.6）个/视野比（45.1±16.1）个/视野、（38.0±18.1）个/视野比（129.2±47.6）个/视野、（48.6±19.4）个/视野比（83.5±46.7）个/视野，差异均有统计学意义（P＜0.05）。移植瘤及肺转移灶中不同证型造模组组间比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论与移植瘤比较，同一证型造模组肺转移灶4T1细胞总体具有更强迁移及侵袭能力；不同证型造模组间比较，寒凝血瘀证肺转移灶4T1细胞侵袭力明显增强，热毒血瘀证移植瘤及肺转移灶4T1细胞迁移力较强。不同血瘀证亚型对小鼠移植瘤及肺转移灶4T1细胞迁移及侵袭能力影响存在差异。

小鼠；中医证候；血瘀证；亚型；移植瘤；转移灶；迁移；侵袭

肿瘤的治疗手段多种多样，但死亡率仍居高不下，其主要原因在于肿瘤的复发及转移仍未能得到有效控制。目前肿瘤的治疗大致分为手术期、辅助治疗期、随访期和姑息治疗期4个不同阶段[1]。中医药在改善肿瘤患者微环境、预防或延缓肿瘤的复发及转移方面有其优势，特别是在完成手术及辅助治疗后的随访期，在现代医学往往不加干预的这一阶段，中医药的有效介入能很好地填补这一治疗空白。目前中医治疗肿瘤的治则大多围绕扶正祛邪进行，辨证施以健脾理气、养阴清热、软坚散结、活血化瘀等。其中除活血化瘀法被质疑外，其余治则在正确辨证的前提下，多有较理想的临床疗效及安全性。多项研究[2]表明，活血化瘀法可改善血液高凝状态及微循环障碍，发挥抑瘤作用,然而也有相关研究[3]发现，活血化瘀法能促进肿瘤的复发及转移，亦或是由于肿瘤来源类型的不同，或活血化瘀药物剂量的不同等，同种活血化瘀药物出现抑制与促进肿瘤复发及转移的双向作用[4-5]。血瘀证广泛存在于肿瘤患者中，有研究发现，肿瘤患者中合并血瘀证者占65.2%[6]。随着对血瘀证研究的逐渐深入,越来越多的研究者意识到血瘀证的肿瘤相关研究存在诸多争议,其根源或许是临床上血瘀证不是一种单一证候,而是因病因病机的不完全相同存在气虚血瘀、气滞血瘀、寒凝血瘀、热毒血瘀等诸多亚型。各亚型除存在微循环障碍或血液流变性异常等血瘀证共性外，又存在各自特性，若不加以区别，往往不能针对病因病机辨证施治，这或许是探索活血化瘀与肿瘤复发转移间关系的关键所在。过往研究多针对于移植瘤肿瘤细胞开展,而本实验研究意在通过体外实验同时观察移植瘤及肺转移灶肿瘤细胞的生物学行为变化，比较之间可能存在的差异，从而对血瘀证有更深入的认识。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雌性8周龄Balb/c小鼠9只，体质量（20±2）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：SYXK（浙）2013-0184。SPF条件下饲养于浙江中医药大学动物实验中心C区：温度（24±2）°C，湿度（55±5）%，噪音＜50db，每12h 1次亮暗循环，2周更换1次敷料，灭菌水及饲料供动物自由摄入。

1.2 细胞系及主要药品及试剂 小鼠乳腺癌细胞：4T1，购自浙江中医药大学实验室。0.1%肾上腺素注射液购自上海禾丰制药有限公司；Lipopolysaccharides（LPS）购自SIGMA公司；RPMI1640培养基、PBS、Hanks试剂购自杭州科易生物技术有限公司；青-链霉素溶液、0.25%胰酶-EDTA、4%多聚甲醛购自吉诺生物医药技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司，结晶紫（Crystal violet）购自Solarbio公司；胎牛血清购自GIBCO公司产品；Matrigel购自BD公司。

1.3 细胞培养及动物模型制备 4T1细胞复苏后于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，置于37℃、5%CO2培养箱内。将SPF条件下培养的9只健康雌性8周龄Balb/c小鼠采用随机分组法分成单纯荷瘤组、寒凝血瘀荷瘤组、热毒血瘀荷瘤组，每组3只。单纯荷瘤组小鼠自由摄食饮水，第15天小鼠乳房脂肪垫下原位注射4T1细胞悬液0.1mL/只（细胞密度约5×106/mL）。寒凝血瘀证荷瘤组小鼠每天定点皮下注射0.1%肾上腺素0.08mL/kg（用生理盐水稀释到0.2mL），分两次注射，第一次注射0.1mL，1h后进行冰浴（4～6℃）4min，然后进行再次皮下注射0.1mL，连续14天，第15天小鼠乳房脂肪垫下原位注射4T1细胞悬液0.1mL/只（细胞密度约5× 106/mL）[7]。热毒血瘀证荷瘤组小鼠每只首次以3mg/ kg的剂量行尾静脉注射LPS溶液0.1mL，20h后起以2mg/kg的剂量行腹腔注射0.1mL，隔天1次，连续14天，第15天小鼠乳房脂肪垫下原位注射4T1细胞悬液0.1mL/只（细胞密度约5×106/mL）[8]。

1.4 细胞原代培养 造模第43天处死三组小鼠,无菌条件下取乳腺移植瘤体组织及肺转移灶组织，采用组织块接种法移植回培养瓶中予含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基体外培养，2天后移去小瘤块，换液后继续培养以扩大细胞总量。

1.5 细胞划痕实验 待细胞进入对数生长期后，取每组细胞接种于6孔板中，每孔细胞数约5×105个。当细胞密集度达90%时，用20μL枪尖垂直划痕，PBS洗去划掉的细胞，加入无血清RPMI 1640培养基，培养箱内常规培养，分别于0、6、12、24h显微镜下拍照，迁移距离的大小表明细胞迁移能力的强弱。计算公式：迁移距离=（0h时划痕宽度-24h划痕宽度）。

1.6 Transwell侵袭及迁移实验

1.6.1 Transwell侵袭实验 用100μL Matrigel稀释液（1：9）包被Transwell小室。取各组对数生长期的细胞，用RPMI 1640培养基重悬细胞，100μL（含细胞总数5×104个）细胞悬液加于上室，下室加含10% FBS的RPMI 1640培养液600μL，每组重复3孔，培养箱内常规培养24h。取出小室，用棉签擦去上室内的未侵袭细胞，倒置，风干，用0.1%结晶紫对小室背面发生侵袭的细胞染色，显微镜下取10个视野拍照计数。

1.6.2 Transwell迁移实验 迁移实验与侵袭实验方法相同,取100μL（含细胞总数3×104个）细胞悬液加于上室，Transwell小室底部膜的内表面上未铺Matrigel。

1.7 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件包，所有数据均采用均数±标准差（s） 表示，两组间均数比较采用t检验、多组间均数比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞划痕试验 单纯荷瘤组、寒凝血瘀荷瘤组、热毒血瘀荷瘤组移植瘤及肺转移灶4T1细胞0至24h平均迁移距离如图1（封三）所示，具体数据见表1。除单纯荷瘤组外,寒凝血瘀荷瘤组、热毒血瘀荷瘤组肺转移灶中细胞迁移距离均大于移植瘤中迁移距离，差异有统计学意义（t=-1.618，P＞0.05；t=-10.318，P＜0.05；t=-27.278，P＜0.05）；在移植瘤中，三组证型造模组间迁移距离存在统计学差异（F=12.629，P＜0.05），热毒血瘀荷瘤组明显大于其余两组，差异有统计学意义（P＜0.05），单纯荷瘤组与寒凝血瘀荷瘤组之间无统计学差异（P＞0.05）；在肺转移灶中,三组证型造模组间存在统计学差异（F=12.640，P＜0.05），寒凝血瘀荷瘤组、热毒血瘀荷瘤组迁移距离均大于单纯荷瘤组（P＜0.05），热毒血瘀荷瘤组较寒凝血瘀荷瘤组迁移距离有增大趋势,但两组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组细胞平均迁移距离比较（μm，±s）

表1 各组细胞平均迁移距离比较（μm，±s）

注：与移植瘤比较，*P＜0.05；与单纯荷瘤组和寒凝血瘀组比较，△P＜0.05；与单纯荷瘤组比较，▲P＜0.05

2.2 Transwell迁移试验 单纯荷瘤组、寒凝血瘀荷瘤组、热毒血瘀荷瘤组移植瘤及肺转移灶4T1细胞24h穿过小室滤膜的细胞数如图2（封三）所示，具体数据见表2。在同一证型造模组中，肺转移灶4T1细胞24h穿过小室滤膜的细胞数均高于移植瘤中4T1细胞穿过数，差异有统计学意义（t=-2.289，P＜0.05；t=-8.585，P＜0.05；t=-2.573，P＜0.05）；在移植瘤中，三组证型造模组间存在统计学差异（F=21.932，P＜0.05），热毒血瘀荷瘤组24h穿过小室滤膜细胞数明显高于单纯荷瘤组与寒凝血瘀荷瘤组，差异有统计学意义（P＜0.05），单纯荷瘤组与寒凝血瘀荷瘤组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；在肺转移灶中，三组证型造模组间存在统计学差异（F=7.803，P＜0.05），寒凝血瘀荷瘤组、热毒血瘀荷瘤组24h穿过小室滤膜细胞数均高于单纯荷瘤组，差异均有统计学意义（P＜0.05），但两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组平均细胞迁移数比较（个/视野±s）

表2 各组平均细胞迁移数比较（个/视野±s）

注：与移植瘤比较，*P＜0.05；与单纯荷瘤组和寒凝血瘀组比较，△P＜0.05；与单纯荷瘤组比较，▲P＜0.05

2.3 Transwell侵袭试验 单纯荷瘤组、寒凝血瘀荷瘤组、热毒血瘀荷瘤组移植瘤及肺转移灶4T1细胞24h穿过小室滤膜的细胞数如图3（封三）所示，具体数据见表3。在同一证型造模组中，肺转移灶4T1细胞24h穿过小室滤膜的细胞数均多于移植瘤中4T1细胞穿过数，差异有统计学意义（t=-3.880，P＜0.05；t=-5.479，P＜0.05；t=-2.183，P＜0.05）；在移植瘤中，三组证型造模组间存在统计学差异（F=6.11，P＜0.05），寒凝血瘀荷瘤组与热毒血瘀荷瘤组24h穿过小室滤膜细胞数均多于单纯荷瘤组，差异有统计学意义（P＜0.05），但该两组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；在肺转移灶中，三组证型造模组间细胞侵袭数差异均有统计学意义（F=21.932，P＜0.05），寒凝血瘀荷瘤组、热毒血瘀荷瘤组4T1细胞24h穿过小室滤膜细胞数大于单纯荷瘤组（P＜0.05）。

表3 各组平均细胞侵袭数比较（个/视野±s）

表3 各组平均细胞侵袭数比较（个/视野±s）

注：与移植瘤比较，*P＜0.05；与单纯荷瘤组比较，▲P＜0.05

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3 讨论

寒为阴邪，寒性凝滞、收引。《黄帝内经》提到，“寒邪博击，易损肌肤脉络脏腑”，“寒独留则血凝泣、凝则脉不通，寒则凝，凝则成瘀。”寒凝血瘀常因外感或内生寒邪，寒邪客于血脉，气机凝滞，血行不畅而致血脉凝滞，脉道瘀塞。热为阳邪，易伤津耗气，迫血妄行，灼伤脉络。《金匮要略》指出：“热之所过，其血必凝”。热毒血瘀常因感受火热之邪，火热内炽，劫耗津血，血行壅滞，脉道瘀塞，血热迫血妄行甚则出血。

有研究[9]发现，寒凝血瘀证球结膜微循环改变特点突出表现为血管扭曲、缺血区、色调暗。热毒血瘀证球结膜微循环改变特点可突出表现为网状畸形、血管增粗、血管壁渗血。现代医学认为寒凝血瘀证的形成是在长期寒冷刺激下，血管收缩，局部血流量减少，微小动脉及毛细血管代偿性地扩张收缩，引起血管内皮损伤，血小板活化功能亢进，出现血液高凝状态。由于微血管的退行改变，内皮细胞出现水肿、核质凝集、坏死脱落等一系列变化，管径缩小、管腔闭锁、毛细血管断裂、致使毛细血管吸收，形成缺血区。而热毒血瘀证由于内毒素直接损伤血管内皮细胞，致血管壁通透性增强，血细胞外渗。并在长期炎症因素作用下，组织嗜碱细胞颗粒释放物、胶原纤维的裂解产物及组织胺等都能促进内皮细胞的增殖，致使新生血管连通，微血管数量增多，从而形成网格结构。

本实验结果发现，在各造模组中，肺转移灶肿瘤细胞侵袭及迁移能力总体强于移植瘤中肿瘤细胞。这可能是由于肺转移灶中这部分肿瘤细胞是从移植瘤中脱落,在血液循环中经过筛选，到达肺脏增殖而来。在此过程中，具有较高迁移力与侵袭力的这部分4T1细胞才能到达肺脏进而形成转移灶，故可见肺转移灶中4T1细胞迁移侵袭能力强于移植瘤中4T1细胞。

此外我们观察到，寒凝血瘀荷瘤组中肺转移灶4T1细胞侵袭能力大幅增强，这也许与寒凝血瘀证中微血管的退行改变有关。寒凝血瘀证中血管量减少，可能一定程度上对肿瘤细胞的侵袭转移形成阻碍，从而致使侵袭至肺转移灶的这部分肿瘤细胞具有更强的侵袭能力。而在热毒血瘀荷瘤组中，我们发现移植瘤与肺转移灶肿瘤细胞具有较强的迁移能力。这可能与热毒血瘀证的形成机制有关。目前普遍认为炎症反应与热毒血瘀证关系较为密切。实验研究[10]也证实热毒血瘀组中TNF-α明显高于其他血瘀证亚型。炎症调节因子和炎症细胞涉及恶性细胞的迁移、侵袭和转移过程。趋化因子受体及其配体通过影响细胞运动性、侵袭力和存活，趋化了炎症、肿瘤和组织稳态过程中细胞的运动。细胞在转化时表达趋化因子受体，在趋化因子帮助下移行并存活于原发肿瘤的远距离位点。故炎症调节因子和炎症细胞能一定程度上影响肿瘤细胞迁移力[11]。

本实验研究证实了不同血瘀证候下小鼠移植瘤及肺转移灶4T1细胞侵袭迁移能力存在差异。在同一证型中，肺转移灶中4T1细胞较之移植瘤总体具有更强的侵袭迁移力。不同证型间，寒凝血瘀证下肺转移灶中4T1细胞具有较强侵袭力，热毒血瘀证下移植瘤及肺转移灶中4T1细胞具有较强迁移力。该实验研究结果提示不同血瘀证亚型微环境对肿瘤细胞的生物学行为存在不同影响，但目前只能说明4T1细胞在该造模方法下会出现如上差异，要更全面地说明问题仍需要更贴合临床的实验研究。在血瘀证患者中，其转移灶肿瘤细胞是否具有更强的侵袭迁移力，不同血瘀证亚型下肿瘤细胞生物学行为是否存在差异，有待更深入研究。

［1］郭勇.中医肿瘤的“四阶段”概念探讨［J］.中华中医药学刊，2009，27（2）：247-248.

［2］郑洋，孙霈，董青，等.恶性肿瘤血液高凝状态中医治疗思路与方法［J］.中国肿瘤，2013，22（12）：1011-1014.

［3］闵亮，祁宏.不同活血方剂对高转移人肝癌裸鼠原位移植瘤生长和转移及肿瘤血管生成的影响［J］.中国中西医结合消化杂志，2014，22（3）：113-117.

［4］庄莹莹，王海琳，杜瑞亭，等.丹参酮ⅡA诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡及机制的研究［允］.国际妇产科学杂志，2011，38（4）：328-330.

［5］陈坚，钟良，钱立平，等.丹参酮ⅡA磺酸钠对MKN-45胃癌裸鼠移植瘤增殖及血管生成的影响［允］.世界华人消化杂志，2008，16（22）：2507-2511.

［6］富琦，张晨曦，杨国旺，等.恶性肿瘤患者凝血指标临床分析及其与血瘀证的相关性［J］.中医杂志，2011，52（23）：2024-2030.

［7］周华妙，郭勇.寒凝血瘀证小鼠动物模型的建立及评价［允］.中国中医药科技，2010，17（1）：1-2.7.

［8］杨超，徐群渊.具有中医“热毒血瘀证”表征的大鼠血液成分和流变学变化［J］.中国比较医学杂志，2007，10（17）：607-612.

［9］胡文娟，张秉韬，吴锐.5种血瘀证亚型家兔模型球结膜微循环改变的比较［J］.中国中西医结合杂志，2013，33（9）：1261-1266.

［10］胡文娟，赵凤达，张秉韬，等.不同血瘀证亚型血小板活化及炎症反应改变的实验研究［J］.世界中西医结合杂志，2011，6（11）：931-934.

［11］吉登波，崔景荣.肿瘤的发生、发展及治疗与炎症的关系［允］.中国新药杂志，2013，19（17）：1551-1555.

（收稿：2015-08-11 修回：2015-12-05）

Effect of Different Subtypes of Blood Stasis Syndrome on the Migration and Invasion of 4T1 Cell Line in Mice with Transplanted Tumor and Pulmonary Metastases

LU Chenwen1,GUO Yong2. 1 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China;2 The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the migration and invasion of 4T1 cell line in Balb/c mice with transplanted tumor and pulmonary metastases with different subtypes of blood stasis syndrome.MethodsNine 8-week-old female Balb/c mice were equally randomized into 3 groups:cancer group,cold coagulation blood stasis-cancer group,heat toxin blood stasis-cancer group.The mice were killed in 43 days after modeling,then the transplanted tumor and tissue specimen from pulmonary metastatic lesion were taken out under aseptic condition.The migration and invasion abilities of 4T1 cells in transplanted tumor and pulmonary metastases in 3 groups were detected with Wound healing assays,Transwell migration,and invasion assays.The data of transplanted tumor and pulmonary metastases in one group were analyzed by t test.The data of the 3 groups in a same tissue origin（transplanted tumor or pulmonary metastases）were analyzed by analysis of variance.ResultsIn cancer group,cold coagulation，blood stasis-cancer group,and heat toxin blood stasis-cancer group,the results of transplanted tumor and pulmonary metastases with the Wound healing assays were as follows:47.5±19.8μm vs 215.8±145.7μm,59.0±8.5μm vs 577.3±70.5μm,118.8±15.2μm vs 663.4±23.8μm;the migration distance was significantly longer in pulmonary metastases than in transplanted tumor in cold coagulation blood stasis-cancer group and heat toxin blood stasiscancer group（P＜0.05）.The results of Transwell migration assay showed significant differences between transplanted tumor and pulmonary metastases in all groups（13.5±8.4/field of vision vs 25.9±12.8/field of vision,17.5±3.8/field of vision vs 49.0±9.7/field of vision,38.5±11.3/field of vision vs 65.8±31.2/field of vision;all P＜0.05）.The results of Transwell invasion assay also showed significant difference in the invasion capability of 4T1 cells between transplanted tumor and pulmonary metastases in all groups（15.8±5.6/field of vision vs 45.1±16.1/field of vision,38.0± 18.1/field of vision vs 129.2±47.6/field of vision,48.6±19.4/field of vision vs 83.5±46.7/field of vision;all P＜0.05）. Significant differences were found in the migration and invasion abilities of 4T1 cells in transplanted tumor and pulmonary metastases among different groups（all P＜0.05）.ConclusionIn the same modeling group,the migration and invasion abilities of 4T1 cells in pulmonary metastases were significantly higher than those in transplanted tumor.The invasion ability of 4T1 cells in pulmonary metastases in cold coagulation blood stasis-cancer group were enhanced,while the migration ability of 4T1 cells both in transplanted tumor and pulmonary metastases in heat toxin blood stasis-cancer group were increased.Different subtypes of blood stasis syndrome have different effects on the migration and invasion of 4T1 cell line in transplanted tumor and pulmonary metastases in mice.

mice;TCM syndrome;blood stasis syndrome;subtypes;transplanted tumor;metastases;migration; invasion

浙江省自然科学基金（No.LY13H290015）；浙江省中医药科学研究基金项目（No.2012ZA049）

1浙江中医药大学（杭州 310006）；2浙江中医药大学附属第一医院肿瘤科（杭州 310006）

郭勇，Tel：0571-86620316；E-mail：lushen20002000@126.com