3种检测艰难梭菌方法的临床应用评估

章黎华，李贞，江岑，万颖蕾，彭奕冰

上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025



3种检测艰难梭菌方法的临床应用评估

章黎华，李贞，江岑，万颖蕾，彭奕冰

上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025

摘要：本研究旨在对3种检测粪便样本中艰难梭菌的方法进行临床应用评估，为艰难梭菌的实验室检测提供参考。采用艰难梭菌毒素A/B(Clostridiumdifficiletoxins A and B，CDAB)酶联免疫荧光检测法、环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂(cycloserin-cefoxitin-fructose agar,CCFA)常规培养法和显色培养法(chromIDTM)同步检测粪便样本中的艰难梭菌，并对培养所得菌株进行tcdB基因扩增以验证其产毒性。以艰难梭菌培养联合tcdB基因扩增为参考方法，分别计算上述3种方法的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等参数，分析其与参考方法的一致性。研究共收集临床粪便样本164份，参考方法检测结果为58份阳性，106份阴性。经统计分析，艰难梭菌毒素A/B法的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为51.7%、95.3%、85.7%和78.3%，CCFA常规培养法分别为72.4%、98.1%、95.5%和86.7%，而艰难梭菌显色培养法分别为94.8%、92.5%、87.3%和97.0%。3种方法中，艰难梭菌显色培养法与参考方法的一致性最高(Kappa=0.856)。采用该方法检测粪便样本中的艰难梭菌操作简便，成本经济，结果判断直观、准确，具有较好的临床应用价值。

关键词：艰难梭菌；检测方法；灵敏度；特异度

艰难梭菌(Clostridiumdifficile，C.difficile)属专性厌氧菌，是抗生素相关性腹泻和伪膜性肠炎的主要病原体[1]。由于抗菌药物频繁使用，艰难梭菌感染已逐渐成为国内外关注的医疗卫生问题[2-5]。肠道菌群失调与艰难梭菌感染密切相关，艰难梭菌通过产生毒素引起肠道炎症、肠壁组织损伤而致病[6]，其主要致病毒素包括毒素A和毒素B。产毒株的毒素型别有A+B+型和A-B+型，A+B-型未见报道[7]。研究表明，毒素B在艰难梭菌致病过程中起主要作用[4]。

艰难梭菌的实验室检测是临床诊断艰难梭菌感染的重要依据，但目前国内尚缺乏标准的艰难梭菌检测方案。本研究对艰难梭菌毒素A/B(C.difficiletoxins A and B，CDAB)酶联免疫荧光检测、艰难梭菌环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂(cycloserine-cefoxitin-fructose agar，CCFA)常规培养和艰难梭菌显色培养(chromogenic medium，chromIDTM)的检测能力进行评估，以期为艰难梭菌感染实验室诊断方法的建立提供有力参考和基础。

1材料与方法

1.1样本来源

收集2015年1月—2015年3月上海交通大学医学院附属瑞金医院临床送检的疑似艰难梭菌感染患者的粪便样本共164份。

1.2主要仪器与试剂

VIDAS全自动免疫分析仪购自法国生物梅里埃公司，GNP-9270型隔水式恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司，ProFlexTMPCR系统购自美国Life Technologies公司，Bio-Rad PowerPac 1000电泳仪购自Bio-Rad公司，Tanon-4100全自动数码凝胶图像分析系统购自上海天能科技有限公司，艰难梭菌毒素A/B检测试剂盒、chromIDTM艰难梭菌鉴定培养基和厌氧产气袋购自法国生物梅里埃公司，无水乙醇、CCFA培养基及添加试剂购自英国Oxoid公司，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.3方法

1.3.1艰难梭菌毒素A/B检测按艰难梭菌毒素A/B检测试剂盒说明书进行操作，用VIDAS全自动免疫分析仪通过酶联免疫荧光法检测粪便样本中的艰难梭菌毒素蛋白A和B，根据试剂盒给定的cut-off值判读结果。

1.3.2艰难梭菌常规培养取约300 mg或300 μL粪便样本与等体积无水乙醇振荡混匀，室温静置1 h；用无菌棉签蘸取上述预处理的样本上清液，密涂法接种于CCFA艰难梭菌选择培养基，37 ℃厌氧培养48 h。典型的艰难梭菌菌落特点为颜色灰白、扁平干燥、边缘粗糙，并伴有马臭味。

1.3.3艰难梭菌显色培养将粪便样本用无水乙醇预处理后，立即接种于chromIDTM艰难梭菌鉴定培养基，37 ℃厌氧培养24 h。艰难梭菌能产β葡萄糖苷酶，与培养基中的显色底物作用可呈现灰黑色菌落，并具备常规培养法的其他菌落特点，据此可进行检测和鉴定。

1.3.4艰难梭菌tcdB基因扩增对上述两种方法培养所得的菌株，采用简化碱裂解法抽提细菌DNA，并进行艰难梭菌毒素B编码基因tcdB的PCR扩增。引物序列为NK104(5′-GTGTAG-CAATGAAAGTCCAAGTTTACGC-3′)和NK105 (5′-CACTTAGCTCTTTGATTGCTGCACCT-3′)，反应体系和条件参考本课题组曾用方法[8]。tcdB基因扩增产物长度为204 bp，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，进行测序验证。由于艰难梭菌产毒株均能分泌毒素B，故可利用tcdB基因扩增对菌株的产毒性进行检测。

1.4数据分析

本研究采用3种方法同步检测每份粪便样本中的艰难梭菌，并对培养所得菌株进行tcdB基因扩增。以艰难梭菌培养联合tcdB基因扩增为参考方法，若同一份样本用艰难梭菌CCFA培养基或显色培养基检出tcdB基因阳性菌株，则判为艰难梭菌感染(阳性)；若两种培养法均无细菌生长或培养所得细菌未检出tcdB基因，则判为非艰难梭菌感染(阴性)。采用SPSS 16.0软件对测试方法与参考方法的一致性进行Kappa分析，并计算灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等参数，评估3种方法的正确率。

2结果

本研究收集的164份粪便样本中，用参考方法检出58份阳性，106份阴性。而采用艰难梭菌毒素A/B检测法、CCFA常规培养法和艰难梭菌显色培养法分别检出阳性35、44和63份，其中对应的真阳性(参考方法结果也为阳性)分别为30、42和55份。3种方法与参考方法对艰难梭菌的检测结果比较见表1。经Kappa检验分析3种方法与参考方法的一致性，得Kappa值分别为0.516、0.746和0.856，表明艰难梭菌显色培养法与参考方法的一致性最高，其次是CCFA常规培养法，而艰难梭菌毒素A/B检测法与参考方法的一致性较低。

计算3种方法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比和约登指数，结果详见表2。

表13种测试方法与参考方法检测艰难梭菌的结果比较

Tab.1Comparison of three test methods with the reference method in detection ofC.difficile

(a)CDABReferencemethodPositiveNegativeTotalPositive30535Negative28101129Total58106164(b)CCFAReferencemethodPositiveNegativeTotalPositive42244Negative16104120Total58106164(c)chromIDTMReferencemethodPositiveNegativeTotalPositive55863Negative398101Total58106164

表23种艰难梭菌测试方法的诊断学参数

Tab.2Diagnostic parameters of three test methods forC.difficile

ParameterTestmethodCDABCCFAchromIDTMSensitivity0.5170.7240.948Specificity0.9530.9810.925Positivepredictivevalue0.8570.9550.873Negativepredictivevalue0.7830.8670.970Positivelikelihoodratio10.96638.37912.565Negativelikelihoodratio0.5070.2810.056Youdenindex0.4700.7050.873

3讨论

近年来，艰难梭菌已成为医院内感染的主要病原体之一，其实验室检测对临床诊断具有重要价值。经2010年美国医疗保健流行病学学会和感染性疾病学会的临床实践指南推荐，艰难梭菌感染的实验室诊断标准为：粪便中检出产毒型艰难梭菌或其毒素，或组织病理学证实为假膜性肠炎[9]。欧美国家对艰难梭菌感染的实验室诊断已日渐成熟，但目前国内开展艰难梭菌常规检测的临床实验室还不多，且尚未建立起公认的较权威的参考方法和诊断标准。

常见的艰难梭菌实验室检测方法包括细菌培养法、免疫法、分子生物学方法等[10-13]。细菌培养法利用传统微生物学技术，可直接培养获得病原体；但无法判断菌株的产毒性，且耗时较长，厌氧培养条件相对严格。免疫法主要有酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)或酶免疫分析法(enzyme immunoassay，EIA)，通过检测艰难梭菌分泌的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，GDH)或毒素蛋白来判断样本中艰难梭菌的存在，操作方便，能在几小时内得到结果；但免疫反应的影响因素较多，存在假阳性和假阴性。PCR则是从基因水平进行检测，灵敏度和特异度较高；但需特定的仪器和配套试剂，如Cepheid公司研发的GeneXpert实时荧光定量PCR法[14]。考虑到成本问题及操作上的技术要求，PCR目前尚未成为临床常用的艰难梭菌检测方法。此外，也有报道表明多种方法联合使用可提高对艰难梭菌的检测效能[15]。

本研究将细菌培养联合tcdB基因扩增作为艰难梭菌检测的参考方法，通过同步接种两种培养基以提高检出率，进一步用PCR扩增tcdB基因对艰难梭菌的产毒性进行验证，同时提高检测的特异度，故该参考方法具有较好的检验效能。经过与参考方法比对，发现3种方法中艰难梭菌显色培养法灵敏度最高，为94.8%，其次为CCFA常规培养法，而艰难梭菌毒素A/B检测法灵敏度较低。这可能是因为艰难梭菌毒素A/B检测法与另外两种细菌培养法不同，检测的是毒素蛋白，由于样本的保存与运送条件不当等造成蛋白降解或抗原变异，从而影响免疫反应结果；当然也不排除存在非产毒型艰难梭菌，其能通过培养法检出，但不产生毒素蛋白。另一方面，3种方法均显示出较高的特异度(>90%)，其中CCFA常规培养法特异度高达98.1%，阳性预测值为95.5%，表明其对艰难梭菌阳性样本的检测能力较强，且误诊率相对较低，但其阴性预测值低于艰难梭菌显色培养法，存在一定的漏诊率。

由于测试方法的阳性和阴性预测值受检测人群患病率的影响，进一步比较3种方法的似然比。结果显示，三者的阳性似然比均较高，即其用于诊断艰难梭菌感染的正确率较高。而3种方法的阴性似然比差异较大，艰难梭菌显色培养法仅为0.056，而艰难梭菌毒素A/B检测法和CCFA常规培养法均为其5倍以上。阴性似然比越小，表明该实验排除患病的正确率越高。故相比之下，艰难梭菌显色培养法对排除艰难梭菌感染具有较高的筛选价值，而另外两种方法不适用于艰难梭菌感染的筛选。综合3种测试方法的诊断学参数，艰难梭菌显色培养法的灵敏度和特异度均较高，约登指数为0.873，具有较好的疾病诊断和筛选能力。

随着临床艰难梭菌感染率逐步升高，实验室快速准确检测艰难梭菌显得尤为关键。采用艰难梭菌显色培养法检测艰难梭菌操作方法较简便，结果判断直观，虽然具有一定的局限性，但比艰难梭菌常规培养法耗时短，较免疫法和PCR成本低，且准确率高，在临床辅助诊断艰难梭菌感染中具有良好的应用价值。

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Corresponding author. WAN Yinglei, E-mail: 178085200@qq.com

·论著·

Clinical evaluation of three methods in detection ofClostridiumdifficilein stool

ZHANG Lihua, LI Zhen, JIANG Cen, WAN Yinglei, PENG Yibing

Department of Laboratory Medicine, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China

Abstract:This study aims to evaluate the clinical performance of three methods in the detection ofClostridiumdifficile(C.difficile) in stool samples. Clinical samples were subjected to enzyme-linked fluorescence assay forC.difficiletoxins A and B (CDAB), conventional bacterial cultivation using cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and cultivation by chromogenicC.difficileidentification medium (chromIDTM), respectively. A combination of bacterial culture and amplification of thetcdBgene was selected as the standard reference method for the evaluation. A total of 164 clinical stool samples were collected, of which 58 had positive results by the reference method whilst the rest 106 were negative. The CDAB method showed a sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of 51.7%, 95.3%, 85.7% and 78.3%, respectively, while the corresponding values of the CCFA method turned out to be 72.4%, 98.1%, 95.5% and 86.7%, respectively. The chromIDTMmethod gave corresponding values of 94.8%, 92.5%, 87.3% and 97.0%, respectively. Among the three methods, chromIDTMmethod had the best consistency with the reference method (Kappa=0.856). It is concluded that chromIDTMis a simple and cost-effective method for the detection ofC.difficilein stool samples, which can present easy-to-judge results and has a preferable value in clinical application.

Key words:Clostridiumdifficile; Detection method; Sensitivity; Specificity

收稿日期：(2015-07-16)

通信作者：万颖蕾

基金项目：国家自然科学基金(81371873), 上海市科学技术委员会基础研究重大项目(12JC1406100)