羊诱导多能性干细胞研究概况

(豆兴堂，李万波，王家明，杨秋凤)

(辽宁省畜牧科学研究院，辽宁 辽阳 111000)



羊诱导多能性干细胞研究概况

(豆兴堂，李万波，王家明，杨秋凤)

(辽宁省畜牧科学研究院，辽宁 辽阳 111000)

摘要：体细胞重编程是产生干细胞的重要途径。体细胞内导入特定的诱导因子，可将其重编程为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，iPSCs同胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)一样具有自我更新并维持未分化状态的能力。利用小分子化合物组合进行体细胞重编程，使iPSCs技术向安全应用更近一步。羊方面已经获得了iPSCs，并生产出了iPSCs 嵌合羊。本文主要从体细胞重编程、iPSCs诱导方法、诱导因子和iPSCs鉴定研究现状作一综述。

关键词：羊；体细胞重编程；诱导多能干细胞

诱导多能干细胞技术是近年来干细胞领域最令人瞩目的一项新兴干细胞制造技术。通过病毒载体或构建的特异载体将特定转录因子组合转入被诱导细胞中，从而诱导已分化的体细胞重编程为未分化的多能细胞，为干细胞应用技术研究开辟了一条新途径。iPSCs与ESCs极为类似，具有多能性和自我更新的能力[1]。iPSCs具有同胚胎干细胞类似的特性并能在适当的诱导条件下分化为3个胚层的细胞，是具有全能分化能力的干细胞。体细胞重编程是实现体细胞向干细胞转化的关键因素。iPSCs重编程方法、诱导因子、鉴定方法等是iPSCs技术的重要研究内容。

1体细胞重编程技术

在哺乳动物发育的过程中，是由具有全能性的受精卵开始，逐渐地经历2细胞、4细胞、8细胞、桑椹胚和囊胚等阶段，最终分化为特定的组织器官形成一个完整个体。这是一个全能性到多能性再到最后的单能性的过程，细胞的可塑性就会逐渐失去，进而成为某一特定类型的细胞。然而，却有一些试验方法可以使不同类型细胞之间的转换成为可能，这就是细胞重编程技术。体细胞重编程主要指的是分化的体细胞在特定的条件下被逆转后恢复具有自我更新能力和分化潜能的胚胎干细胞状态[2]。目前最常用的重编程方法包括：体细胞核移植、体细胞与胚胎干细胞进行融合、特定转录因子诱导技术等。

1.1体细胞核移植重编程为多能干细胞

体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT)技术是研究最早的细胞重编程技术。早在1952年Briggs与King[3]首次报道了林蛙成功核移植试验，并且成功孵化出正常的蝌蚪。到2007年Egli[4]等以成年小鼠体细胞作为供核细胞，以受精卵作为受体，通过核移植技术获得多能性细胞。总之，从动物克隆结果看，细胞核重编程效率与供核细胞分化程度成反比，克隆囊胚分离ESCs克隆和正常胚胎克隆，克隆效率都非常低，通过SCNT技术获得ESCs系在技术上还存在困难。

1.2体细胞与ESCs融合重编程为ESCs

细胞融合技术(cellular fusion)，将体细胞与胚胎癌细胞、胚胎生殖细胞、ESCs融合，可以发生重编程为多能干细胞。2001年Tada等[5]利用电融合技术，将体细胞与小鼠ESCs融合，得到多能性细胞。2005年Cowan等[6]报道了人类ESCs通过融合后得到多能性细胞的研究。由于融合细胞内存在ESCs基因组，移植排斥反应不可避免，如何真正去除这些ESCs来源的基因组是目前还不容易克服的难题。

2006年Takahashi与Yamanaka等[7]使用逆转录病毒载体把24个与细胞多向分化潜能和保持多能分化状态相关的候选基因逐一导入小鼠胚胎成纤维细胞中(mouse embryonic fibroblasts，MEF)，最终明确了 Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4这4种转录因子(OSKM)导入MEF后能够对细胞进行基因重组编程，获得了具有ESCs特性的细胞。这些细胞在细胞形态、生长特性以及畸胎瘤形成能力等方面，都与ESCs非常相似，并将其命名为iPSCs。2007年Yamanak等[8]和Thomson[9]分别采用相同的基因改造方法将人体细胞重编程为类ESCs，具有与ESCs几乎一样的生物学特性，即iPSCs。这些研究成果为后续研究奠定了基础，开启了干细胞研究新途径。

2IPS细胞重编程方法

小鼠与人类iPSCs最初是应用逆转录病毒载体[7]和重组慢病毒载体[8]重编程体细胞完成的。其诱导效率当时在所有诱导方法中是最高的，但这两种诱导系统会将其携带的基因整合到宿主细胞基因组中，会增加iPSCs致瘤的可能性。随着研究深入，研究人员试验出了一些新的转录因子导入重编程方法。

2.1外源载体诱导

逆转录病毒载体和慢病毒载体导入外源基因，使获得的诱导细胞具有较高的致瘤性，在临床上应用受到了很大的阻碍。Okita等[9]将携带有外源基因的普通质粒作为载体导入细胞，成功获得小鼠iPSCs，但此法诱导效率低且诱导所用的时间较长。外源载体诱导DNA重编程也即非病毒载体介导的DNA分子重编程。Woltjen等[10]利用OSMK 组合、2A 序列(自剪切多肽编码序列)和piggyBac转座子构建多顺反子载体导入细胞，诱导获得了iPSCs；同时证明了2A序列之间的重编程因子被完全移除，实现了外源基因沉默。piggyBac转座系统转座频率和准确率较高，适用范围更广，是一个非常有效又比较安全的载体。Jia等[11]利用微环DNA诱导获得来源于脂肪干细胞的iPSCs，微环DNA缺失了细胞分裂的相关基因，保证了iPSCs的稳定性。但这些方法无法完全避免基因重组和插入突变，诱导效率普遍较低。

2.2RNA的诱导方法

有mRNA 诱导和 miRNA 诱导两种方式。Warren等[12]应用mRNA诱导人多样细胞类型重编程为干性细胞比当时其他方法更高效，且能使iPSCs更高效分化为终末分化肌细胞。潘传英等[13]研究发现Oct4、Sox2、猴病毒40大T抗原的mRNA以一定比例混合后转染靶细胞，诱导因子均能特异性表达并正确定位在细胞核；各诱导因子不仅具有相应的生物学活性而且还协同作用激活了细胞内源性干性标志基因Nanog的表达。这种方法更容易控制外源目的基因在靶细胞中的表达量和表达时间，但是足量的特定mRNA较难获得。

2.3小分子化合物诱导

Hou等[14]2013年研究表明，小分子化合物能重编程小鼠体细胞为多能干细胞。该方法完全无基因整合，致癌风险低，成为iPSCs研究领域的新趋势。Hou等利用 7个小分子组合 (VPA、CHIR99021、616452、Tranylcypromine、Froskolin、3-deazaneplanocin A 和 TTNPB)，成功将小鼠体细胞重编程为iPSCs，命名为化学诱导的多潜能干细胞(CiPSCs)。将小鼠CiPSCs注射到8-细胞卵裂球或桑椹胚中获得了嵌合鼠，其中CiPSCs可以整合到包括性腺在内的所有的器官当中，而且可以传递给后代，证明其是完全重编程的。这一发现更有利于深入理解细胞命运决定和转变的机制，在iPSCs研究领域意义重大。

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3一些主要的iPSCs诱导因子

自从2006年Takahashi与Yamanaka等报道重编程小鼠MEF细胞成功获得iPSCs以来，Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等因子是细胞重编程中较为关键的转录因子。

3.1Oct4

Oct4是Oct家族的同源转录因子，包括POU区域在多能干细胞中，ESCs、EG细胞、EC细胞和mGS细胞中表达。Zaehres等[15]研究表明，抑制人和小鼠ESCs中Oct4基因的表达，ESCs就不能维持自我更新，将会分化为滋养层细胞。这表明Oct4在维持ESCs多能性和促进分化上具有很重要的作用。因此，Oct4常常被用于检测ESCs是否保持未分化状态的标志性基因[16]。

3.2Sox2

Sox2是Sox蛋白在ESCs中的表达形式[17]。Masui等[18]研究发现将小鼠ESCs的Sox2敲除，会导致细胞向滋养外胚层分化。同时发现导入Sox2或者Oct4的cDNA可以缓解Sox2的敲除产生的影响。表明Sox2和Oct4一样，对于维持细胞的多能性来说是很重要的，Sox2的作用可能是控制Oct4的表达。

3.3Nanog

Nanog是Chalnbers等[19]2003年在小鼠和人的ESCs中发现的一类在维持ESCs多能性方面具有强大功能的内源性转录因子，Nanog缺失的小鼠胚胎不能维持外胚层的多能性。在体外培养的ESCs，终止Nanog的表达导致ESCs的自发分化。外源的Oct4、Sox2和其他的转录因子进入体细胞后，可能直接通过相互联系的自身调节环路诱导内源Oct4、Sox2和Nanog的表达，之后这些因子通过维持自身的表达和激活多能性转录网络实现诱导细胞的多能性[20]。显然Nanog与Sox2和Oct4一起在维持多能性方面发挥着重要作用。

3.4Lin28

Lin28基因是一种非常保守的RNA连接蛋白，也是一个翻译加速器或推进器，通过启动多核糖体mRNA来增加蛋白合成效率，来提高ESCs与iPSCs等多能性干细胞重编程效率[21]。Balzer和Moss[22]认为，Lin28基因还能阻止一种叫做let-7基因的miRNA加工，抑制由于miRNA原因引起的干细胞分化，从而保证干细胞多能性的维持。

近年来，研究者发现小分子化合物能促进重编程过程，在染色质的修饰、信号转导途径等方面发挥作用。

3.5组蛋白去乙酰化酶抑制剂

Huangfu等[23]研究发现多种影响细胞重编程的化学抑制剂。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，如丙戊酸(VPA)，曲古抑菌素A(TSA)和suberoylanilide hydroxami cacid(SAHA)都能显著地提高重编程效率。化学处理可以作为一种途径在动力学和效率方面提高重编程。可传代的生殖系细胞也已通过VPA的处理使OSK(Oct4，Sox2，Klf4等转录因子组合)参与的重编程诱导出的多能性干细胞获得。因此，VPA的处理和细胞多能性的诱导过程是相一致的。Huangfu等研究表明，在VPA存在时，OSK诱导的原代成纤维细胞重编程的效率提高，比先前研究报道的效率高10～20倍。相关研究说明在使用VPA处理的情况下，Oct4和Sox2是人成纤维细胞进行重编程所必备的。

3.6天然化合物维生素 C(Vc)

包括成纤维细胞在内的体细胞在体外培养时都会发生细胞衰老现象，部分原因是因为在细胞代谢过程中产生的活性氧(ROS)的聚集。有研究表明，Vc可促进小鼠和人类 iPSCs的产生效率。Vc 促进重编程效率可能在某种程度上是通过降低活性氧的水平而实现的。

此外，还有DNA 甲基转移酶抑制剂(AZA和5-AzadC)，5-AzadC是AZA的同系物，都是DNA甲基化抑制剂，可通过使特定区域的基因去甲基化从而激活相关的基因。细胞分裂素活化蛋白激酶/胞外信号调节激酶(MEK)和糖原合成激酶-3信号通路抑制剂，能够促进ESCs维持自我更新，有助于ESCs的增殖。

4iPSCs鉴定

iPSCs与ESCs相似，从形态上讲一般都生长成集落，集落内的细胞小而密集，有较大的细胞核，有1～2个清晰可见的核仁，具有较高的核质比[7]。由于iPSCs与ESCs具有相似的特性，可报告特异性关键基因如Nanog和Oct4，鉴定挑选iPSCs[16]。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)在未分化的多能性细胞中含量大，而分化的多能性细胞不表达或者弱表达AP，多能性细胞维持未分化状态检测的重要指标之一就是AP呈阳性。因此iPSCs应该具有AP活性，经AP染色后呈阳性。iPSCs在功能上必须具有分化为具有三个胚层不同组织细胞的能力，采用免疫细胞化学方法检测不同胚层的特异性抗原，如βⅢ微管蛋白(外胚层)、结蛋白(中胚层)、α胎儿球蛋白(内胚层)等，可以对iPSCs的体外分化特性进行鉴定。产生生殖系嵌合是判断多能性细胞的一个重要指标，将获得动物多能性细胞通过显微操作的方法注射入同物种的桑椹胚或者囊胚中，将注射后的胚胎移植到动物体内，产生嵌合体动物，来验证iPSCs的多能性。体内分化实验即畸胎瘤验证，iPSCs注射到免疫缺陷小鼠的背部或肌肉组织内，经过一段时间的生长后可以产生畸胎瘤，通过组织学方法可以检测是否形成瘤体。iPSCs的鉴定和评价应该根据研究目的选择鉴定评价方法，若重演完全的细胞核重编程过程，那么最终得到的细胞要能够产生嵌合体；若产生有效的干细胞用于药物开发等用于人类疾病医疗，那么最终得到的细胞只要具有自我更新能力并能产生有效的子代就可以。

5iPSCs技术前景

在羊iPSCs 研究方面，已经能完全重编程体细胞为iPSCs，并且生产出了嵌合体羊。Bao等[24]先后获得了能形成畸胎瘤和拟胚体并具有正常核型的羊iPSCs。 Liu等[25]将绵羊iPSCs注入到二倍体或四倍体胚胎中，形成了内细胞团的部分结构，但未形成嵌合体。Sartori等[26]用鼠OSMK诱导绵羊成纤维细胞，产生iPSCs，经核型、畸胎瘤和拟胚体鉴定为完全重编程；将获得的iPSCs移植入胚胎后，生出了嵌合体的小羊。

iPSCs研究经过10年的探索，已经取得很大进展，但iPSCs的生物安全性和低效率等问题制约着其广泛应用，这是未来iPSCs研究需要解决的关键问题。若提高iPSCs生产效率，确保其生物安全，将会促进其在转基因动物、优质动物种质资源的保护、濒危动物保护、再生医学等领域的应用，具有广阔前景。

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Overview of Ovine Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

DOU Xing-tang,LI Wang-bo,WANG Jia-ming,YANG Qiu-feng

(Institute of Animal husbandry of Liaoning province Liaoyang 111000)

Abstract：Somatic cell reprogramming was important way of produced stem cell.Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be generated from somatic cells by ectopic-expression of specific inducing factors，which are capable of maintaining self-renewal and an undifferentiated state just like embryonic stem cells (ESCs).The technique of iPSCs will be close to safe application by used a number of small-molecule compounds aiming at replacing some transcription factors，reprogramming somatic cell and finally succeeding in obtaining iPSCs completely induced by a group of chemicals without any genetic manipulation.Some researchers have obtained iPSCs and also generated chimera of lambs on ovine iPSCs reseach.This review presents a general progress on somatic cell reprogramming，the inducing methods，the inducing factors as well as the research status of identifying iPSCs.

Key words：Ovine；Somatic cell reprogramming；Induced pluripotent stem cells (iPSCs)

中图分类号：S826.3；S814.8

文献标识码：B

文章编号：1005-2739(2016)03-0003-05

作者简介：豆兴堂(1978-)，男，农业推广硕士，高级畜牧师。主要从事辽宁绒山羊繁殖育种与胚胎工程技术研究与推广工作。E-mail：dou791120@sina.com

收稿日期：2016-03-01