不同茧色类型家蚕品种资源的茧壳和蚕蛹的总黄酮含量及蚕蛹的黄酮类物质组成分析

刘影侠 杜贝贝 岳 玲 黄 涛 司马杨虎，2 徐世清，2

(1苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州 215123; 2现代丝绸国家工程实验室，江苏苏州 215123)

不同茧色类型家蚕品种资源的茧壳和蚕蛹的总黄酮含量及蚕蛹的黄酮类物质组成分析

刘影侠1杜贝贝1岳 玲1黄 涛1司马杨虎1，2徐世清1，2

(1苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州 215123;2现代丝绸国家工程实验室，江苏苏州 215123)

我国彩色茧丝家蚕品种资源丰富，而且彩色茧丝具有保湿、抑菌、抗氧化、防紫外线等特性;而蚕蛹不仅富含蛋白质而且含有多种活性物质及大量人体所需的微量元素。因此，茧壳和蚕蛹的开发日趋倍受关注 。以7533限等17个不同茧色类型家蚕品种资源为材料，检测蚕茧茧壳和蚕蛹中黄酮类化合物的含量，并通过高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC)分析蚕蛹中的黄酮类物质芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和绿原酸的含量。结果显示，不同茧色家蚕品种资源蚕茧茧壳中黄酮类化合物含量由高到低的顺序为绿色茧＞黄色茧＞白色茧，而不同茧色类型家蚕品种资源间蚕蛹中黄酮类化合物含量差异不显著。并且蚕蛹的黄酮类物质中不含绿原酸;绿色茧家蚕品种资源蚕蛹中的槲皮素、异槲皮苷含量比其他茧色家蚕品种资源蚕蛹的含量高，黄色茧家蚕品种资源蚕蛹不含或含有较低的芦丁。这为更好地开发利用天然彩色茧和蚕蛹资源提供重要的参考。

家蚕;天然彩色茧;黄酮类化合物;蚕蛹;槲皮素

家蚕是一种重要的经济昆虫，其所衍生的各类产品正逐步向成熟的产业化生产阶段发展。家蚕茧色分为白色茧和彩色茧，彩色茧主要分为黄红茧系和绿茧系两大类，黄红茧系包括淡黄、金黄、肉色、红色、锈色等，绿茧系包括淡绿和绿色2种［1］。黄红茧系的茧丝颜色来自桑叶中的2种类胡萝卜素，一种是非极性的胡萝卜素，另一种是极性的含氧类胡萝卜素，又称之为叶黄素;而绿茧系的茧丝颜色主要来自黄酮类化合物［6］。研究者还发现家蚕茧荧光的产生主要与重组家蚕体内黄酮类物质的高表达相关［2－3］。

黄酮类化合物(Flavonoids)，主要指具有色酮环与苯环为基本结构的一类化合物的总称，是一类小分子的天然活性物质。研究表明，黄酮类化合物对人体具有消除氧自由基、抗氧化、抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝、雌激素样作用，以及保护心脑血管系统、抗病毒和杀虫等生理活性，且毒副作用小［4］。另外，黄酮类化合物还具有防止钙质流失和改善动物生长等作用［5］。槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物，化学名为3，3'，4'，5，7－五羟基黄酮，具有多种生物学活性及很高的药用价值，其药理作用广泛，不仅有抗氧化及清除自由基的作用，还有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降压、免疫调节及心血管保护等作用［5］。此外，还具有止泻、抗血栓、抗肥胖、抗抑郁等作用［6］。家蚕蛹自古以来就是滋补食疗的珍品，其丰富的有效活性成分具有独特的药理作用。本文分析比较了不同茧色类型家蚕品种资源茧壳和蚕蛹中黄酮类化合物的含量，并采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC)测定蚕蛹中的绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素5种活性成分的含量，以期对蚕蛹药材质量控制标准的提高，以及为含蚕蛹的成药制剂质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 蚕品种资源及其处理 7533限等17个试验用家蚕品种资源均由苏州大学遗传与发育研究室提供，具体家蚕品种资源名称及茧色详见表1。

表1 家蚕品种资源及其茧色分类

1.1.2 主要试剂和仪器 芦丁标准品，由国药集团化学试剂有限公司提供;异槲皮苷(批号: 15070211)、槲皮素(批号:15090717)、绿原酸(批号:15041814)、紫云英苷(批号:14120515)、芦丁(批号:14082710)对照品，均由中国食品药品检定研究院提供(以上所有试剂均为供含量测定用)。甲醇(色谱纯)，由美国Fisher公司提供;乙醇等化学试剂均为分析纯，上海生工生物工程有限公司产品;水为超纯水。

1.1.3 主要仪器 KQ－500DB型数控超声波器，昆山超声波仪器有限公司产品;DK－8B型电热恒温水槽及DHG－9246A型电热恒温鼓风干燥箱，均为上海精宏实验设备有限公司产品;安捷伦液相色谱仪Agilent 1200、KQ－500DB型数控超声波器，均为昆山超声波仪器有限公司产品;分光光度仪，美国贝克曼库尔特有限公司(BECKMAN COULTER)产品。

1.2 试验方法

1．2．1 茧壳和蚕蛹样品的制备 7533限等17个不同品种资源，采用常规桑叶育饲养家蚕，结茧化蛹3 d后分别采茧、削茧取出蚕蛹。(1)茧壳和蚕蛹中总黄酮含量测定样品的制备。随机选取7533限等13个不同品种资源(表1中的前13个品种资源，以下相同)雌、雄各10粒的蚕蛹、茧壳分别装袋，并按表1中的代号进行编号，蚕蛹保存于－70℃的冰箱中备用，对应茧壳常温保存备用。测定时将蚕蛹从冰箱中取出，然后用剪刀将蚕蛹剪成两半置于恒温烘箱中50℃干燥96 h以上，最后用研钵研磨成蚕蛹粉。茧壳的烘茧条件:初烘时温度设定为100℃，时间2 h;复烘时温度设定为95℃，时间2 h，用剪刀剪碎试样茧壳。(2)蚕蛹中5种黄酮类物质含量测定样品的制备。随机选取2个白色茧品种(7533限、菁松 B)、2个黄色茧品种(皓42JH橘、皓12黄)、2个绿色茧品种(0903JGJ、大造)的蚕蛹各20粒(雌、雄混合)分别装袋，并按表1中的代号进行编号，按照1．2．1项“(1)茧壳和蚕蛹中总黄酮含量测定样品的制备”的方法制备蚕蛹粉。

1.2.2 芦丁标准曲线的建立 称取10 mg芦丁标准品，置于50 mL的容量瓶内，加入75%的乙醇溶液定容至50 mL，得到0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。然后分别取芦丁标准溶液0、1、2、4、5、6 mL后加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液，摇匀后静置6 min，加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液，混合后静置6 min，加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液混匀，加入75%的乙醇溶液定容至25 mL，使芦丁标准溶液的浓度分别为0、0.008、0.016、0.032、0.040、0.048 mg/mL，然后在510 nm下测定吸光值，空白区用纯水代替芦丁标准溶液，处理同上，3个重复。得到回归方程y= 10.982 0 x+0.001 1，相关系数R2=0.997 6，质量浓度与对应的吸光度呈良好的线性关系(图1)。

1.2.3 不同茧色类型家蚕品种资源的茧壳和蚕蛹的总黄酮含量测定 (1)试样液的制备。①蚕蛹粉试样液的制备。用电子天平分别准确称取0.3 g 7533限等13个各茧色类型家蚕品种资源雌、雄的蚕蛹粉，加入到10 mL的75%的乙醇溶液中，超声波预先处理20 min，再在60℃的水浴锅中抽提3 h，过滤除去不溶物，最后将滤液放置于4℃的冰箱中避光过夜，吸取上层液作为下一步试验的蚕蛹粉试样液。②蚕茧壳试样液的制备。蚕茧壳试样液的制备和蚕蛹粉的方法相似，即用电子天平分别准确称取0.5 g 7533限等13个各茧色类型家蚕品种资源雌、雄的蚕茧壳，放入试管中，每支试管加入75%的乙醇溶液10 mL，然后放置到超声波中处理30 min，放到60℃的水浴锅里抽提4 h，过滤除去杂质，收集第1次抽提的滤液，将剩余的蚕茧壳再重复抽提1～2次，直到蚕茧壳上的色素全部被抽提出来，最后将各次抽提的滤液合并定容于25 mL的标准容量瓶中至25 mL，放置于4℃的冰箱中避光过夜，同样也是吸取上层液作为下一步试验的茧壳试样液［7－8］。

(2)总黄酮类化合物含量的测定。①蚕蛹粉中总黄酮类化合物含量的测定。采用分光光度法，分别准确量取1 mL 7533限等13个各茧色类型家蚕品种资源雌、雄的蚕蛹粉试样液于10 mL的容量瓶中，加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液摇匀，静置6 min，加入 0.3 mL 10%的 Al(NO3)3溶液混匀，静置6 min，加入4 mL 1 mol/L的 NaOH溶液后，再用75%的乙醇溶液定容至10 mL，于510 nm下测定吸光值，以75%的乙醇溶液代替蚕蛹粉试样液作空白校正。对照标准曲线求出蚕蛹中总黄酮类化合物的含量。②蚕茧壳中总黄酮类化合物含量的测定。分别准确量取5 mL 7533限等13个各茧色类型家蚕品种资源雌、雄的茧壳试样液于10 mL的容量瓶中，按照1.2.3(2)项“①蚕蛹粉中总黄酮类化合物含量的测定”方法，测定蚕茧茧壳中的总黄酮类化合物的含量。

1.2.4 不同茧色类型家蚕品种资源蚕蛹中5种黄酮类物质含量的HPLC测定 (1)色谱条件。Sepax GP－C18色谱柱(4.6 mm×250 mm×5 μm);柱温: 30℃;流速:0.8 mL/min;进样量:20 μL;流动相A: 0.05%H3PO4水溶液;流动相B:乙腈;波长:254 nm。在此条件下各组分分离度良好(表2)。

表2 各组分色谱分离梯度

(2)标准溶液的制备。称取绿原酸1.0 mg、异槲皮苷1.0 mg、槲皮素2.5 mg、紫云英苷2.5 mg、芦丁2.5 mg，然后加入80%的甲醇溶液分别定容于10 mL的容量瓶中至10 mL，得到100 mg/L绿原酸溶液，100 mg/L异槲皮苷溶液，250 mg/L槲皮素溶液，250 mg/L紫云英苷溶液，250 mg/L芦丁溶液作为标准储备液。分别取1 mL标准储备液定容到50 mL的容量瓶中至50 mL，配成标准使用液。然后，再将标准使用液稀释成不同浓度的标准溶液，具体质量浓度如表3所示。

表3 4种黄酮类化合物以及绿原酸溶液的质量浓度mg/L

(3)HPLC下芦丁等标准曲线的建立。分别用绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷和槲皮素标准溶液进样20 μL，按照1.2.4项“(1)色谱条件”测定峰面积。然后以标准溶液质量浓度(mg/L)为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线(图2－6)。

图2 绿原酸标准曲线

图3 异槲皮苷标准曲线

图4 槲皮素标准曲线

图5 紫云英苷标准曲线

图6 芦丁标准曲线

(4)供试样品溶液的制备。分别取7533限和菁松B(白色茧)、皓42JH橘和皓12黄(黄色茧)、0903JGJ和大造(绿色茧)的蚕蛹粉，精确秤取0.3 g，置于具塞试管中，加入80%的甲醇溶液10 mL，塞上试管塞，超声波处理(250 W，37 kHz)30 min，在60℃水浴中抽提4 h，过滤除去不溶物，将滤液置于4℃的冰箱中避光过夜，吸取上层液作为试样液，进行家蚕蛹黄酮类化合物的组成鉴定。

2 结果与分析

2.1 茧壳和蚕蛹中总黄酮类化合物的含量

2.1.1 不同茧色类型家蚕品种资源茧壳中总黄酮类化合物的含量 7533限等3类茧色类型13个家蚕品种资源雌、雄茧壳中总黄酮类化合物的含量如图7所示。绿色茧茧壳中黄酮类化合物的含量最高，平均含量为1.30 mg/g左右，比白色茧茧壳中的含量高近4倍，其次是黄色茧茧壳中的含量为0.90 mg/g，白色茧茧壳中的含量较低，平均含量为0.34 mg/g。对茧色间的差异显著性进行了比较(t检验)，绿色茧茧壳中黄酮类化合物含量极显著高于白色茧茧壳中的含量(P＜0.01)，而黄色茧茧壳中黄酮类化合物含量与白色茧茧壳之间不存在差异性，并且绿茧系彩色茧的茧色深浅与黄酮类化合物的含量高低直接相关。但是，也有一些黄色茧品种资源的茧壳中黄酮类化合物的含量低于白色茧品种资源的现象，说明并非所有彩色茧品种资源的茧壳中黄酮类化合物的含量都比白色茧品种资源的高。

图7 7533限等3类茧色类型13个家蚕品种资源茧壳中总黄酮类化合物的含量

2.1.2 不同茧色类型家蚕品种资源蚕蛹中总黄酮类化合物的含量 7533限等3类茧色类型13个家蚕品种资源雌、雄蚕蛹中总黄酮类化合物的含量见图8。白色、黄色以及绿色3类茧色家蚕品种资源蚕蛹中的黄酮类化合物的含量介于 2.30～4.40 mg/g。对茧色间的差异显著性进行了分析(t检验)，结果显示3种茧色家蚕品种资源蚕蛹中黄酮类化合物的含量不存在显著性差异。分析图8，可以发现同一品种资源蚕蛹中黄酮类化合物的含量远远高于其在茧壳中的含量，分别高1～10倍不等，并且在一些品种资源间，蚕蛹中黄酮类化合物的含量相差很大，这就为挖掘高黄酮蚕蛹品种资源和开发家蚕蛹的药用价值提供了一定的参考。

图8 7533限等3类茧色类型13个家蚕品种资源蚕蛹中总黄酮类化合物的含量

2.2 茧壳和蚕蛹中总黄酮类化合物含量的关系分析

从图9中可知，有些家蚕品种资源相比其他家蚕品种资源，蚕蛹和茧壳中黄酮类化合物的含量都比较高，如L6JR×0903JGJ(♀黄色茧，茧壳中的含量为2.127 6 mg/g，蚕蛹中的含量为3.692 4 mg/g)、L6JR×0903JGJ肉 (♀黄色茧，茧壳中的含量为1.922 7 mg/g，蚕蛹中的含量为3.624 1 mg/g)等;有些家蚕品种资源的蚕蛹和茧壳中黄酮类化合物的含量都比较低，如黄42皓·皓(♀黄色茧，茧壳中的含量为0．306 4 mg/g，蚕蛹中的含量为2.781 8 mg/g)等。在这2种情况中，蚕蛹和茧壳中的黄酮类化合物含量都表现出明显的一致性，即茧壳和蚕蛹中均含有较高或较低的黄酮类化合物。但也存在一些家蚕品种资源相比其他家蚕品种资源，蚕蛹中黄酮类化合物的含量较高而茧壳中的含量较低，如皓10R金(♂黄色茧，茧壳中的含量为0.306 9 mg/g，蚕蛹中的含量为3.358 5 mg/g)等;还有一些家蚕品种资源茧壳中黄酮类化合物的含量较高，而蚕蛹中的含量偏低，如 0826(♀黄色茧，茧壳中的含量为1.358 1mg/g，蚕蛹中的含量为2.728 7mg/g)等。

图9 7533限等3类茧色类型13个家蚕品种资源蚕蛹和茧壳中总黄酮类化合物的含量

2.3 家蚕蛹黄酮类化合物的组成及其鉴定

取7533限、菁松B、大造、0903JGJ、皓42 JH橘、皓12黄 6个家蚕品种资源的蚕蛹，分别按照“1.2.4”项下的“(4)供试样品溶液的制备”方法制备供试样品溶液、进样测定，获得各供试样品溶液色谱图谱(图10)。

图10 7533限(A)、菁松B(B)、大造(C)、0903JGJ(D)、皓42JH橘(E)、皓12黄(F)蚕蛹中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷和槲皮素4种黄酮类化合物有效成分HPLC图

通过HPLC检测，7533限等6个家蚕品种资源的家蚕蛹的黄酮类化合物中均未检测到绿原酸，家蚕蛹中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素4种黄酮类化合物的含量检测汇总结果如图11所示:不同茧色类型家蚕品种资源蚕蛹中总黄酮类化合物的含量不同，相同茧色不同家蚕品种资源蚕蛹中黄酮类化合物的种类和含量也存在明显的差异，绿色茧家蚕品种资源蚕蛹的槲皮素、异槲皮苷的含量，比其他茧色家蚕品种资源蚕蛹的槲皮素、异槲皮苷的含量高，这2种黄酮类化合物可作为绿色茧的标记物;黄色茧家蚕品种资源蚕蛹不含或含有较低的芦丁。桑叶中含有丰富的绿原酸，家蚕以桑叶为食料，但是家蚕蛹中却检测不到绿原酸，说明绿原酸并不能像黄酮类化合物一样被家蚕修饰吸收。

图11 HPLC测定家蚕蛹中4种黄酮类化合物的含量

3 讨论

天然彩色茧的色素来源于桑叶或蚕体内自身合成，无毒无害、色彩自然、色调柔和，具有天然彩色棉无法比拟的优势，因此近年来丝绸类产品快速兴起，家蚕逐渐得到科学界和工业界的广泛关注和重视［9－11］。也有研究发现，彩色茧家蚕品种资源中黄酮类化合物的总量普遍高于白色茧，而且黄酮类化合物具有抗氧化、抗过敏、抗炎、抗菌等作用，进而推测彩色茧丝具有这些白色茧丝所没有的特性［12－14］。在对家蚕茧色的研究中，类胡萝卜素和类黄酮类化合物被证实与彩色茧的成色机制密切相关［1］。但是，对蚕蛹中黄酮类化合物的研究还相对较少，蚕蛹中黄酮类化合物的分离研究则更少。本文研究结果显示，天然绿色和黄色蚕茧的茧壳与白色蚕茧的茧壳相比，含有较高的黄酮类化合物，但也存在少数彩色茧的茧壳黄酮类化合物的含量低于部分白色蚕茧的茧壳的现象;绝大部分品种资源蚕蛹中的黄酮类化合物含量都比相同家蚕品种资源蚕茧茧壳的含量高。

目前市场上的黄酮类功能食品琳琅满目，如防衰老食品、提高免疫力食品、降脂食品、降压食品等，产品以液体、固体和半液体等多种形式存在，如桑叶茶、桑叶营养荞麦面、苦荞保健茶等［15］。很多研究表明，蚕蛹中铁、锌、铜、锰的含量超过牛奶、大豆、猪肝，特别是蚕蛹蛋白中富含锌、钾等［16－19］。随着研究的不断广泛和深入，使得蚕蛹作为具有特殊意义的一种热门食品或食品添加剂的角色而出现在我们的生活中［17］，蚕蛹中功能性活性成分的研究将有助于蚕蛹的深度开发利用。本文通过对7533限等13个家蚕品种资源的研究发现，天然彩色茧中绿色茧家蚕品种资源蚕蛹的总黄酮类化合物的含量显著高于黄色茧和白色茧家蚕蚕蛹，并且不同家蚕品种资源的蚕蛹中黄酮类化合物的含量也存在明显差异。

通过对7533限等6个不同茧色类型家蚕品种资源蚕蛹中黄酮类化合物芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和绿原酸的含量的检测，发现蚕蛹中均不含有绿原酸，并且绿色茧类型家蚕品种资源蚕蛹中槲皮素、异槲皮苷含量也高于其他茧色的蚕蛹。槲皮素在体外对各种自由基的清除作用已被许多实验所证明［21］，因此可以推测绿色茧家蚕品种资源蚕蛹的营养价值高于其他茧色的蚕蛹，这不仅可用于蚕蛹药材质量控制标准的提高，也可为含蚕蛹的成药制剂质量控制提供参考。但是蚕蛹中黄酮类化合物的种类众多、成分极其复杂、含量较低，并具有多种多样的生物活性［22］;因此，从蚕蛹中提取或分离纯化黄酮类化合物具有重要的应用前景。

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S881.2

A

1007－0982(2016)02－0022－08

2016－01－29;接受日期:2016－03－22

现代农业产业技术体系建设专项(编号CARS－22)。

第1作者信息:刘影侠(1991—)，女，安徽宿州，硕士研究生。E-mail:lyx1534367485@163．com

信息:司马杨虎，男，教授，硕士生导师。Tel:0512－65880255，E-mail:simyh@suda．edu．cn