重组丝氨酸蛋白酶抑制剂对链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠的影响

于纪棉　王建峰张玉琳　黄素文倪健波(宁波卫生职业技术学院，浙江　宁波　3500)



重组丝氨酸蛋白酶抑制剂对链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠的影响

于纪棉王建峰1张玉琳黄素文1倪健波1(宁波卫生职业技术学院，浙江宁波315100)

〔摘要〕目的探讨重组丝氨酸蛋白酶抑制剂( Vaspin)对链脲佐菌素( STZ)诱导的2型糖尿病大鼠的影响。方法通过体外表达获得重组Vaspin蛋白。采用高脂饲料加小剂量注射STZ诱导2型糖尿病SD大鼠模型，对照组大鼠给予普通饲料喂养。将造模成功的大鼠随机分成两组，实验组腹腔注射100 μl 0．5 mg/ml重组Vaspin蛋白，模型组以生理盐水代替，每天给药1次，连续给药2 w后，进行口服吐葡萄糖耐量( OGTT)试验;分离血清，测定总胆固醇( TC)、甘油三酯( TG)、低密度脂蛋白胆固醇( LDL－C)、高密度脂蛋白胆固醇( HDL－C)、空腹血糖( FBG)、空腹胰岛素( FINS)以及肿瘤坏死因子( TNF)－α，瘦素( Lep)的水平。结果OGTT结果显示经过重组Vaspin蛋白腹腔注射治疗后的糖尿病大鼠血糖变化曲线接近于正常，且2 h后下降至对照组大鼠水平。经过Vaspin蛋白治疗2 w后，实验组大鼠的TC、TG、LDL和FBG、FINS、胰岛素抵抗( IR)均显著降低，脂肪因子Lep和TNF－α下降至正常水平。结论该研究获得的重组Vaspin具有活性，可以降低糖尿病大鼠的血糖，改善糖尿病大鼠的糖脂代谢和IR水平。

〔关键词〕重组丝氨酸蛋白酶抑制剂;糖尿病大鼠模型;胰岛素抵抗

1宁波出入境检验检疫局技术中心

第一作者:于纪棉( 1983－)，女，讲师，博士，主要从事病理和人体形态教学研究。

肥胖是2型糖尿病发病的独立高危因素，可以引起胰岛素抵抗( IR)和胰岛素分泌功能障碍，而IR是2型糖尿病发病的一个重要原因〔1〕。最新研究证明，脂肪组织不仅是机体能量的储存器，而且也是重要的内分泌器官，它可分泌大量的脂肪因子〔2〕，这些脂肪因子可直接或间接影响机体糖脂代谢，与IR、2型糖尿病关系密切。内脏脂肪组织来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂( Vaspin)是一种新发现的脂肪因子，有研究表明，Vaspin在肥胖和2型糖尿病中起着重要的作用。本文通过对链脲佐菌素( STZ)诱导2型糖尿病大鼠注射重组的Vaspin，观察治疗效果，探讨其在改善IR中的作用机制。

1材料与方法

1. 1实验动物及分组清洁级SD雄性大鼠50只，由浙江省医学科学院实验动物中心提供〔实验动物许可证号: SCXK(浙) 20080033〕，随机分为正常对照组、糖尿病模型组、实验组。每组10只。

1. 2试剂和仪器STZ购自美国Sigma公司;胰岛素( INS)、总胆固醇( TC)、甘油三酯( TG)、低密度脂蛋白胆固醇( LDL－C)、高密度脂蛋白胆固醇( HDL－C)、肿瘤坏死因子( TNF)－α和瘦素( Lep)酶联免疫吸附( ELISA)试剂盒(上海源叶生物科技有限公司) ;重组Vaspin蛋白(本实验室保存) ;活力型血糖仪(美国罗氏公司) ;酶标仪MD SpectraMax M5(美国MD公司)。

1. 3获得重组Vaspin蛋白以大鼠睾丸脂肪细胞总RNA为模板，RT－PCR扩增脂肪因子Vaspin基因，亚克隆到原核表达载体PET－30a获得重组质粒pET－30－Vaspin，转化至E．coli BL21 ( DE3)菌株后进行诱导表达，表达产物用Ni柱进行纯化以获得重组Vaspin蛋白。

1. 4 2型糖尿病大鼠模型制备SD大鼠适应性饲养1 w后，参照参考文献〔3〕复制糖尿病模型。采血前禁食12 h。测定大鼠空腹血糖( FBG)，以血糖含量大于16．7 mmol/L为大鼠2型糖尿病模型造模成功的判定标准。

1. 5口服葡萄糖耐受量试验将造模成功的大鼠随机分为模型组和实验组，每组10只。模型组和对照组腹腔注射100 μl生理盐水，实验组腹腔注射100 μl 0．3 mg/ml重组Vaspin蛋白，每天给药1次，连续给药2 w后，进行口服葡萄糖耐受量试验( OGTT)，试验前大鼠禁食12 h，用10%葡萄糖溶液( 2 g/kg)灌胃，于灌胃前0 h、灌胃后0．5、1、2 h尾静脉取血测定血糖。

1. 6血脂、IR和其他脂肪细胞因子的测定SD大鼠连续给药2 w后，1%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，静置1 h后，4℃、3 500 r/min离心10 min，分离血清，置－20℃冰箱冷藏保存，用于空腹胰岛素( FINS)、TC、TG、LDL－C、HDL－C以及TNF－α，Lep的测定。IR指数，采用稳态模型评估法( HOMA)中的公式HOMA IR=FINS×FBG/22．5计算〔4〕。

1. 7统计学分析采用SPSS17．0软件进行单因素方差分析。

2结果

2. 1 Vaspin对2型糖尿病大鼠OGTT的影响模型组大鼠在0、0．5、1、2 h的血糖水平均高于对照组和实验组( P＜0．01)，实验组在0、0．5、1、2 h的血糖水平与对照组之间无显著变化。见表1。

表1重组Vaspin对2型糖尿病大鼠葡萄糖耐受实验的影响(±s，n=10，mmol/L)

表1重组Vaspin对2型糖尿病大鼠葡萄糖耐受实验的影响(±s，n=10，mmol/L)

与模型组比较: 1) P＜0．01，2) P＜0．05，下表同

组别　0 h　0．5 h　1 h　2 h对照组　6．01±0．411)　10．71±2．021)17．34±1．291)　7．68±0．871)模型组　17．86±1．03　 29．61±2．63　 34．48±3．21　 25．12±2．01实验组　8．86±0．571)　13．03±1．971)19．13±2．471)　9．09±0．561)

2. 2 Vaspin对2型糖尿病大鼠血脂的影响模型组大鼠TG、TC、LDL－C明显高于对照组( P＜0．01，P＜0．05) ;实验组的TG、TC、LDL－C明显低于模型组( P＜0．01，P＜0．05)，但与对照组相比无显著差异。实验组和模型组HDL－C水平与对照组相比均无显著变化。见表2。

2. 3 Vaspin对糖尿病大鼠FBG、FINS和IR的影响给药2 w后，模型组大鼠FBG平均明显高于对照组( P＜0．01) ;实验组大鼠FBG水平明显低于模型组( P＜0．01)，但与对照组相比无显著差异。模型组和实验组大鼠血清FINS水平均明显高于对照组( P＜0．01) ;实验组血清FINS水平与模型组相比显著下降( P＜0．05)。模型组大鼠IR显著高于对照组( P＜0．01) ;与模型组相比，实验组大鼠IR显著下降( P＜0．01)，但与对照组相比无显著差异。见表3。

2. 4 Vaspin对脂肪因子Lep、TNF－α水平的影响与对照组比较，模型组Lep、TNF－α水平明显高于对照组( P＜0．05) ;实验组Lep、TNF－α水平明显低于模型组( P＜0．05)，但与对照组相比无显著差异。见表4。

表2重组Vaspin对2型糖尿病大鼠空腹血脂的影响( n=10±s，mmol/L)

表2重组Vaspin对2型糖尿病大鼠空腹血脂的影响( n=10±s，mmol/L)

组别　TG　TC　HDL－C　LDL－C对照组　1．48±0．191)　0．66±0．181)　1．06±0．17　 0．91±0．052)模型组　2．37±0．21　 1．65±0．51　 1．26±0．25　 1．25±0．23实验组　1．81±0．081)　0．67±0．141)　1．17±0．31　 0．92±0．062)

表3重组Vaspin对2型糖尿病大鼠FBG、FINS、IR的影响( n=10±s)

表3重组Vaspin对2型糖尿病大鼠FBG、FINS、IR的影响( n=10±s)

组别　FBG( mmol/L)　 FINS( mU/L)　IR对照组　6．52±0．281)　22．51±3．331)　6．58±0．971)模型组　21．3±1．62　 35．3±8．07　 47．72±6．89实验组　7．03±0．881)　30．3±3．582)　9．47±1．061)

表4重组Vaspin对2型糖尿病大鼠Lep和TNF-α的影响( n=10±s，ng/L)

表4重组Vaspin对2型糖尿病大鼠Lep和TNF-α的影响( n=10±s，ng/L)

组别　Lep　TNF－α对照组　7．51±0．412)　64．1±7．182)模型组　8．48±0．72　78．3±12．6实验组　7．87±0．452)　65．4±7．452)

3讨论

Vaspin与其他脂肪因子相比，其独特性在于主要在哺乳动物的内脏脂肪组织中表达，并且与肥胖关系密切，正常糖调节人群中随着BMI升高，表达Vaspin的个体比例也随之增高，而非肥胖者脂肪组织中未检测出Vaspin mRNA表达〔5〕。本实验重组Vaspin蛋白具有明显降血糖作用，并提示重组的Vaspin能改善由高脂高糖诱导的2型糖尿病大鼠的胰岛素敏感性，这与国外相关研究结果较为一致〔6〕。

本实验结果说明Vaspin对改善糖尿病大鼠糖代谢、脂代谢起积极的作用。国内外的其他研究也证实Vaspin与血糖和血脂指标的关系密切，并可能参与了糖、脂代谢紊乱的发生发展〔7，8〕。朱慧静等〔9〕对临床上60多列单纯性肥胖进行调查研究发现Vaspin与INS及TG呈显著正相关。

Lep也是由脂肪组织合成与分泌的一种细胞因子，具有加快能量消耗，抑制脂肪合成，调节糖代谢相关酶的作用，是能量和代谢的主要调节因子。本研究中糖尿病大鼠经过重组Vaspin治疗后，可以明显降低糖尿病大鼠体内Lep水平，推测Vaspin可能通过与Lep相互作用来调节能量代谢。相关研究也证实血清Lep水平在2型糖尿病患者中明显高于正常者，Lep与糖尿病、IR紧密关联〔10〕。前炎性反应状态是引起IR和胰岛β细胞功能失调的重要标志〔6〕。本研究中糖尿病大鼠经过重组Vaspin治疗后大鼠体内TNF－α水平显著降低，推测Vaspin可能通过抑制由脂肪因子或血管细胞来源的细胞因子所诱导的炎性反应，从而改善IR。

夏常杰等〔11〕研究表明利拉鲁肽治疗2型糖尿病患者后，糖脂代谢及胰岛β细胞功能改善，胰岛素敏感性增加，同时患者血浆Vaspin水平升高;孙莉等〔12〕利用罗格列酮，体外作用于分化成熟的3T3－L1脂肪细胞，可以检测到Vaspin mRNA表达上调;由此推测某些治疗2型糖尿病的药物通过诱导Vaspin的表达水平来降低血糖，改善IR。而本实验通过腹腔注射Vaspin后使糖尿病大鼠空腹血糖和IR的水平降低，由此推测Vaspin可能成为有效的治疗糖尿病途径之一。

综上所述，由高脂高糖和小剂量STZ诱导的2型糖尿病大鼠，经重组Vaspin治疗后可降低糖尿病大鼠的血糖，改善糖尿病大鼠的血脂和IR，进一步提示Vaspin与和2型糖尿病有密切关系，为2型糖尿病治疗提供思路，但其降血糖的作用机制以及对IR的信号通路的影响尚需进一步研究。

4参考文献

1李光伟，宁光，周智广．2型糖尿病早期胰岛素强化治疗改善胰岛β细胞功能——是现实还是梦想〔J〕．中华内分泌代谢杂志，2006; 22 ( 4) : 392．

2 Miner JL．The adipocyte as endocrine cell〔J〕．J Anim Sci，2004; 82: 935．

3于纪棉，张岳灿，张玉琳，等．SD大鼠2型糖尿病模型的建立〔J〕．浙江医学，2012; 34( 24) : 1958－9．

4李光伟，潘孝仁，Lillioja S，等．检测人群胰岛素敏感性的一项新指数〔J〕．中华内科杂志，1993; 32( 10) : 656．

5 Ye Y，Hou XH，Pan XP，et al．Serum vaspin level in relation to postprandial plasma glucoseconcentration in subjects with diabetes〔J〕．Chin Med J( Engl)，2009; 122( 21) : 2530－3．

6 Hida K，Wada J，Eguchi J，et al．Visceral adipose tissue derived serine protease inhibitor: a unique insulin sensitizing adipocytokine in obesity 〔J〕．Proc Natl Acad Sci USA，2005; 102( 30) : 10610－5．

7 Bluher M．Vaspin in obesity and diabetes: pathophysiological and clinical significance〔J〕．Endocrine，2012; 41( 2) : 176－82．

8陈燕，李伶，杨刚毅，等．糖代谢改善对2型糖尿病患者血浆vaspin水平的影响〔J〕．中国糖尿病杂志，2012; 20( 9) : 650－2．

9朱慧静，成兴波，鲁燕．单纯性肥胖者血清Vaspin水平与胰岛素抵抗的相关性〔J〕．江苏医药，2010; 36( 8) : 892－4．

10张静．Vaspin、脂联素、瘦素与糖尿病周围神经病变相关性的研究〔D〕．济南:山东大学，2011．

11夏常杰，李伶，杨刚毅，等．利拉鲁肽对2型糖尿病患者血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂水平的影响〔J〕．中国老年学杂志，2011; 31( 2) : 181－3．

12孙莉，王长江，代芳，等．白细胞介素－6和罗格列酮对3T3－L1脂肪细胞Vaspin mRNA表达的影响〔J〕．安徽医科大学学报，2009; 44( 1) : 26－31．

〔2014－09－17修回〕

(编辑曹梦园)

通讯作者:王建峰( 1981－)，男，兽医师，硕士，主要从事动物模型、分子生物学的研究。

基金项目:浙江省教育厅科研项目( Y201432068) ;浙江省自然科学基金( Y12H070001) ;宁波市自然科学基金( 2011A610030)

〔中图分类号〕R587. 1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0268-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 005