高盐饮食对更年期焦虑小鼠海马钾离子－氯离子共转运体2、钠－钾－氯离子失转运体1表达的影响

秦莉花　李　晟叶丽芝黄　宽陈晓阳，2，3(湖南中医药大学护理学院，湖南　长沙　40208)



高盐饮食对更年期焦虑小鼠海马钾离子－氯离子共转运体2、钠－钾－氯离子失转运体1表达的影响

秦莉花李晟1叶丽芝1黄宽1陈晓阳1，2，3(湖南中医药大学护理学院，湖南长沙410208)

〔摘要〕目的研究高盐饮食对更年期焦虑症小鼠钾离子－氯离子共转运体2( KCC2)、钠－钾－氯离子共转运体1( NKCC1)表达的影响。方法

将大鼠随机分为空白组、模型组、4%高盐饮食组、8%高盐饮食组。其中4%高盐饮食组、8%高盐饮食组经高盐饮食干预1个月后，HE染色观察脑部结构，免疫组织化学观察KCC2、NKCC1表达情况。结果高盐饮食使更年期焦虑小鼠海马区锥体细胞排列紊乱，神经元数目明显减少，细胞轮廓模糊，出现大量的空泡现象，细胞形态不规则，细胞间隙明显增大;模型组KCC2表达的阳性细胞明显减少，高盐饮食组阳性细胞极少;模型组NKCC1表达阳性细胞明显增多，高盐饮食组阳性细胞增多更明显。结论高盐饮食加重更年期焦虑症的发生可能与KCC2及NKCC1之间的动态平衡被打破有关。

〔关键词〕高盐饮食;更年期焦虑症;钾离子－氯离子共转运体2;钠－钾－氯离子共转运体1

1湖南中医药大学药学院2中药现代化教育厅重点实验室3国家中药管理局药性与药效研究三级实验室

第一作者:秦莉花( 1980－)，女，副教授，博士，主要从事更年期相关疾病研究。

更年期焦虑症不仅影响患者的健康、社会关系、家庭生活等方面，还可引起其他精神障碍疾病，甚至产生自杀行为，且直接关系到老年期疾病的发生。因此其防治研究是临床医护人员乃至整个社会所面临的重要任务。随着年龄增长，人们味觉功能下降，在日常生活中表现为食物咸味重，研究表明我国人均吃盐及人均每天食盐摄入量均超标〔1〕。本研究探讨高盐饮食对更年期焦虑小鼠钾离子－氯离子共转运体2( KCC2)、钠－钾－氯离子共转运体1( NKCC1)的影响。

1材料与方法

1. 1实验动物选用11月龄的昆明雌性小鼠，清洁级，体重35～45 g，由长沙市开福区东创实验动物科技服务部代购，动物合格证号: scxk(湘) 2009－0012。饲料均来自于由长沙市开福区东创实验动物科技服务部。

1. 2试剂与仪器羊抗鼠KCC2、NKCC1多克隆抗体购自美国Sigma公司。低温大容量高速离心机(型号: KDC－2046低温大容量离心机，中国科学技术大学科技实业有限公司) ;电子天平(型号: ES－C－600电子天平，湘仪天平仪器有限公司)。

1. 3分组连续5 d进行小鼠阴道涂片检查，呈现不规则动情周期的小鼠为自然更年期小鼠。将40只更年期小鼠随机分为空白组、模型组、4%高盐饮食组、8%高盐饮食组。分组后空白组和模型组小鼠继续给予普通饲料，4%高盐饮食组小鼠予含4%的NaCl高盐颗粒饲料，8%高盐饮食组小鼠予含8%的NaCl高盐颗粒饲料喂养，自由摄食，自由饮用自来水，连续1个月。

1. 4模型制备①高架十字迷宫模型:参照文献〔2〕自制高架十字迷宫，测试方法参照〔2，3〕。②明暗箱:参照文献〔2，4〕自制，测试测试方法参照〔2，3〕。③旷场实验:参照文献〔5〕自制，测试测试方法参照〔3，4〕。

1. 5 HE染色实验第31天取材，麻醉灌注取脑，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，常规HE染色，脱水透明封固，制成切片，光学显微镜观察。

1. 6免疫组织化学实验第31天取材，麻醉灌注取脑，4%多聚甲醛固定，经脱水、透明、包埋，选择海马部位冠状位连续冷冻切片。以SABC法进行免疫组织化学:加入0．3% H2O210 min，3%正常山羊血清封闭10 min;滴加一抗( 1∶100)，过夜(阴性对照组以正常羊血清替代一抗)，加入羊抗兔IgG、SABC，室温放置2 h，PBS冲洗铺片，DAB显色剂显色，脱水，封片。每只大鼠取3张切片，每张切片选取3个无重叠在显微镜(× 400)下观察海马区NKCC1、KCC2的表达情况。

1. 7统计学方法组间比较行t检验。

2结果

2. 1高盐饮食对更年期焦虑症小鼠脑部结构的影响空白组海马区细胞排列整齐，细胞核圆而大，核仁清晰可见，锥体细胞排列整齐，层次紧密;模型组海马区锥体细胞排列较紊乱，神经元数目减少，细胞轮廓较清晰，出现空泡现象，细胞形态不规则，细胞间隙相对增大;高盐饮食组海马区锥体细胞排列紊乱，神经元数目明显减少，细胞轮廓模糊，出现大量的空泡现象，细胞形态不规则，细胞间隙明显增大，8%高盐饮食组表现比4%高盐饮食组更明显，见图1。

2. 2高盐饮食对更年期焦虑症小鼠脑海马KCC2表达的影响在高倍光学显微镜下，观察细胞阳性着色情况，与空白组比较，模型组KCC2表达阳性细胞明显减少，高盐饮食组阳性细胞极少，且4%和8%高盐组之间没有明显的差异。见图2。

2. 3高盐饮食对更年期焦虑症小鼠脑海马NKCC1表达的影响在高倍光学显微镜下，观察视野范围内细胞阳性着色情况，与空白组比较，模型组NKCC1表达阳性细胞明显增多，高盐饮食组阳性细胞增多更明显，但4%和8%高盐组之间没有明显的差异。见图3。

图1高盐饮食对更年期焦虑症小鼠脑部结构的影响( HE，×400)

图2高盐饮食对更年期焦虑症小鼠脑海马KCC2的影响( DAB，×400)

图3高盐饮食对更年期焦虑症小鼠脑海马NKCC1的影响( DAB，×400)

3讨论

合理的饮食结构是现代中医护理中饮食护理的中心内容之一。目前提倡合理的饮食结构，虽根据每个人的机体状况而有所不同，但总体而言首先应避免偏嗜。早古代医家就已强调饮食不宜过咸，应少吃盐。现代文献也报道食物与人的情绪有关，如多食咸味、甘味，使盐、糖摄入过多，情绪容易激动。澳大利亚学者曾历时10年的跟踪调查结果显示，饮食结构与抑郁、焦虑等精神紊乱之间存在密切的关系〔5〕。

KCC2分布于神经元细胞膜上的转运蛋白，是神经元细胞内氯离子外排的主要因素，使Cl－由细胞内移向细胞外，降低胞内的Cl－浓度; NKCC1分布于上皮细胞和非上皮细胞膜上，则顺着内向Na梯度促使Cl－由细胞外移向细胞内，促进细胞内Cl－堆积，故Cl－排出系统( KCC2)及Cl－聚集系统( NKCC1)之间的动态平衡决定中枢神经系统中〔Cl－〕i。γ－氨基丁酸( GABA)产生兴奋性和抑制性作用之间的进行转化的关键因素在神经元细胞内Cl－浓度差〔6〕，而功能相反的氯离子共转运体KCC2/ NKCC1是中枢神经系统内调节Cl－浓度差、调控GABA效应转化的关键因素〔7，8〕。研究表明，KCC2基因敲除的大鼠，其脑内GABA的抑制作用下降〔9〕。NKCC1 mRNA表达增高及KCC2mRNA表达降低的变化可能引起神经元细胞内Cl－浓度增高，Cl－梯度的崩溃，Cl－内流减少，细胞膜超级化减弱，从而导致GABA能抑制作用的减弱，神经元高兴奋性，使癫痫易感性增加〔10〕。课题研究前期采用EPM、高架十字迷宫成功制备焦虑症模型，且高盐饮食可加重动物焦虑程度，减少其活动次数〔3〕，本研究结果显示高盐饮食加重更年期焦虑症的发生可能与高盐饮食使细胞内外的Na+、Cl－水平发生改变，KCC2及NKCC1之间的动态平衡被打破，但具体机制有待进一步研究。

4参考文献

1崔同样，黄静，郭海宁．我国居民食用食盐的研究分析〔J〕．内江师范学院学报，2011; 26( B07) : 189－91．

2 HG沃格尔，WH沃格尔．药理学实验指南新药发现和药理学评价〔M〕．北京:科学出版社，2001: 280．

3黄宽，叶丽芝，李晟，等．高盐饮食对更年期焦虑症小鼠的行为学的影响〔J〕．湖南中医杂志，2013; 29( 12) : 130－2．

4张均田．现代药理实验方法(上册)〔M〕．北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998: 1047．

5徐志伟，王文竹，苏俊芳，等．逍遥散和丹栀逍遥散抗焦虑作用的实验研究〔J〕．广州中医药大学学报，2006; 23( 4) : 330－1．

6孙兵．改变饮食结构可缓解抑郁焦虑情绪〔J〕．老年健康，2011; 6 ( 1) : 4．

7王晓民．神经科学进展(四)〔M〕．北京:高等教育出版社，2006: 139－ 46．

8 Kahle KT，Staley KJ，Nahed BV，et al．Roles of the cation chloride cotransporters in neurological disease〔J〕．Nat Clin Pract Neurol，2008; 4 ( 9) : 490－503．

9 Galanopoulou AS．Developmental patterns in the regulation of chloride homeostasis and GABA( A) receptor signaling by seizures〔J〕．Epilepsia，2007; 48( Suppl) : 514－8．

10王德广．氯离子转运体KCC2和脑缺血的研究〔D〕．安徽:中国科学技术大学，2005．

〔2014－09－09修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者:陈晓阳( 1953－)，女，教授，主任医师，硕士，硕士生导师，主要从事中药药性理论基础与应用、药理研究。

基金项目:湖南省教育厅科研项目( No．12C0253)

〔中图分类号〕R271. 19

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0270-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 006