肝脏肿瘤标本资源库的建立、维护及管理

严锦，程思杰，余灵祥，洪智贤，吴建中，王瑞兰，张克明，孙百军，张培瑞，王兆海，杨鹏辉，张绍庚（中国人民解放军第三〇二医院　肝胆外科中心，北京　100039）



肝脏肿瘤标本资源库的建立、维护及管理

严锦，程思杰，余灵祥，洪智贤，吴建中，王瑞兰，张克明，孙百军，张培瑞，王兆海，杨鹏辉，张绍庚
（中国人民解放军第三〇二医院肝胆外科中心，北京100039）

[摘 要]目的探讨建立以肝癌组织样本为主的肝脏外科生物样本库及相关数据信息化管理的方法和标准化操作规程，为临床与基础研究提供高质量的临床标本资源平台。方法 收集肝脏肿瘤手术患者的血液标本（血清、血浆、白细胞）、组织标本(癌、癌旁、远端正常组织)，将处理好的血液标本于-80 ℃冰箱保存，新鲜组织置液氮保存，定期随机抽取液氮保存的肿瘤组织样本进行RNA、DNA的提取及鉴定。结果现收集并保存有完整临床信息及随访资料的肝脏肿瘤患者血液标本22 103份，组织标本3 319例，其中肝脏肿瘤组织标本807例，包括肝脏恶性肿瘤762例，良性肿瘤23例，肝硬化组织22例。随机抽取组织RNA、DNA鉴定均符合标本质量标准，能够满足后续实验要求。结论 初步建立标准化、规范化的肝脏肿瘤标本库，制定了标准化的标本库维护和管理规程，为肝脏肿瘤基础和临床研究提供了宝贵的实验材料。

[关键词]肝脏肿瘤；生物样本库

Establishment,maintenance and management of liver tumor biobank YAN Jin,CHENG Si-jie,YU Ling-xiang,

HONG Zhi-xian,WU Jian-zhong,WANG Rui-lan,ZHANG Ke-ming,SUN Bai-jun,ZHANG Pei-rui,WANG Zhao-hai,YANG Peng-hui,Zhang Shao-geng.Center of Hepatobiliary Surgery,302 Military Hospital,Beijing 100039,China

Abstract objectiveTo study the measures and standard operation procedure for establishing the biobank of liver surgical samples and information management of related data about samples,providing a high quality clinical specimen resource platform for clinical and basic research.MethodsBlood samples from patients with liver tumor(serum,plasma,leukocyte)and tissue samples(cancer tissues,tissues adjacent to carcinoma and the distal normal tissues)were collected,and then be kept in -80 ℃ refrigerator or in liquid nitrogen for preservation.Samples were randomly selected for the extraction and identification of RNA and DNA.ResultsA total of 22 103 blood samples with complete clinical information and follow-up data of liver tumor patients were collected and saved,807 cases of tissue specimens,of which there were 762 cases of malignant liver tumor,23 cases of benign tumors,22 cases of liver cirrhosis.Random tissue specimens of RNA and DNA identifications were preserved in high quality standards and could meet the requirements of the following studies.Conclusion A standardized and normalized liver tumor specimen biobank is established and the standard specimen library maintenance and management procedures are formulated,which provides valuable experimental materials for basic and clinical research for liver tumor.

Key words liver tumor; biobank

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，简称肝癌）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率第3位，死亡率第2位[1]。近年来肝癌在世界范围内发病率仍呈现上升趋势，尤其在东南亚国家肝癌的高患病率和高病死率（总体病死率0.95），已成为当前社会主要的健康威胁之一[2]。肝癌长期预后欠理想，根治性切除术后，其5年累积复发率仍高达70%，而且复发肝癌比原发肿瘤的侵袭性更高[3-4]。总而言之，肝癌相关研究仍缺乏关键性进展，HCC现在仍严重威胁着人类的健康和生命。

不同于大多数其他类型的癌症，肝癌有着独特且复杂的肿瘤发生、发展机制，这种复杂性对肝脏肿瘤标本库科学合理的分类和建立提出了极大挑战。一方面，肝癌的主要发病因素除了原发性外，研究者更倾向于关注包括乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、肝硬化、脂肪肝及代谢疾病等诱导的肝癌发生机制[5-6]。从世界范围看，肝炎的分布区域与肝癌的高发区域基本重合，肝脏的慢性炎症也被认为是肝癌发生和发展的主要危险因素。另一方面，肝脏是许多异质性恶性肿瘤（如恶性消化道肿瘤、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤、神经内分泌瘤等）转移、定植的最易受累区域之一，约35%的结肠癌患者在其病程发展过程中已形成肝转移癌[7-10]。可以说，肝癌临床上复杂的特性对于其标本库的建立提出更为苛刻的要求。建立、管理及维护肝脏肿瘤标本库，规范、合格、准确地保存肝癌组织样本，完整临床数据对于肝癌发生的相关发病机制和遗传易感性等基础医学研究具有决定性作用，对于临床上早期发现、精确分期，对患者提供个体化治疗显得尤为关键[11]。

本中心依托肝病专科医院、解放军传染病研究所的临床资源优势，成功建立肝脏肿瘤生物样本库及其信息管理系统，其职责是系统采集、保存和开发利用以肝癌患者为主的手术切除组织和血液标本，对其进行维护管理，为临床与基础研究提供合格的临床标本资源平台。

1 材料和方法

1.1标本来源

全部肝脏肿瘤样本源来自2013年10月至2015年9月就诊于本中心的患者，纳入标准：（1）诊断为原发性肝癌、肝脏良性肿瘤及原发性肝癌肝内转移的患者；（2）患者样本采集均符合医学伦理学标准。排除标准：（1）其他肿瘤转移到肝脏上的患者；（2）术前接受过介入或射频热毁损治疗者；（3）HIV及梅毒阳性者予以排除。

1.2仪器设备

三洋-80 ℃冰箱（MDF-53V），海尔DW-86L626超低温冰箱并配套金属冻存管盒架，-20～4 ℃冰箱（海尔BCD-215KS），微量加样器（Eppendorf），生物安全柜（Thermo1300 SERIES A2），液氮罐，离心机等。

1.3标本收集

1.3.1血清和血浆的采集、处理及保存：符合纳入标准进行手术治疗的患者均采集血液标本。患者术

前、术中、术后当天至出院前等不同时间段取血，每次采抗凝及不抗凝3 mL各一管，不抗凝血室温静置2 h后，3 000 r/min离心10 min，用微量加样器小心吸取血清，按每管200 μL分装成4份，作蛋白组学的分析；另1份3 mL EDTA抗凝，采血后轻轻颠倒混匀3次静置，防止溶血。抗凝后2 h内分离血浆，1 500 r/ min离心20 min，用微量加样器小心吸取血浆，按每管200 μL分装成4份。然后用吸管在界面白膜处吸取白细胞留取2份于冻存管中保存。血浆、血清、白细胞在采血后2 h内冻存在-80 ℃冰箱中。

1.3.2组织标本的采集、处理及保存：（1）新鲜组织的采集及保存：符合纳入标准进行手术治疗的患者在不影响病理诊断取材的前体下收集组织标本。由专人在标本离体后30 min内，取肿瘤组织（尽量冲尽血液）、癌旁组织（癌组织旁1～3 cm以内）、正常组织（癌组织旁5 cm以外或最远处）。用相机拍摄记录标本取材部位，将标本切成小块（0.5 cm×0.5 cm，厚度＜0.5 cm），标记后迅速放入液氮保存。

1.3.3标本的标记和储存：上述标本分装入冻存管，在电脑虚拟标本库中相同位置登记入库，打印出小瓶标签。标签分为两部分，一为圆形的单独二维码，一为长方形标签，标签内容分为两行：一行为患者ID号，一行为小瓶标志符。标识符包括入库日期、疾病类型、样本ID、性别、样本类型、样本管数。将标签贴于标本瓶身，圆形二维码贴于瓶盖面。例如，标本小瓶标志符140612C22HBA0001812FBP1代表的是2014年6月12日入库，乙肝肝癌，样本ID号0001812，女性，血浆1号。

1.3.4生物样本数据库的信息化管理：采用美国RURO公司FreezerPro冷冻样品智能信息系统。（1）样本源信息录入：①标准区域：患者住院号（ID号）、姓名；②用户自定义区域：性别、年龄、随访联系方式、病理号、有无其他疾病（肝性脑病、冠心病、高血压、糖尿病、肾病）、病史（病毒感染史、治疗史、吸烟史、饮酒史、其他重要疾病史等）。（2）样本信息录入：①标准区域：患者住院号（ID号）、姓名、容量、样品源、样品组、样品所有者；②用户自定义区域：采集日期、入库日期、疾病类型编码、采集时间段、术后/日、复查术后/月、离心后样品状态、负责医生、采集人员、收集人员、处理人员），临床信息（血常规检测、肝功检测、凝血功能检测、肿瘤标志物、肝炎指标、肝癌早期预警、甲戊肝三项、自身抗体五项、淋巴细胞亚群测定、自身免疫性肝病、肝纤维四项、其他检查）。（3）标本使用管理：①标本出库清单：申请编号、申请人、出库日期、出库人、标本类型、名称编号、精确位置、出库状况、出库数量、用户签收；②标本使用反馈表：日期、申请编号、项目名称、使用人姓名、联系电话、单位、标本质量、标本要求、标本类型、标本数量、使用人签名。

1.3.5标本的质量检测：每2周定期随机抽取组织及血液标本，按照试剂盒说明书操作，抽提RNA、DNA，并对其完整性进行检测。

2 结果

2.1标本收集情况

截至2015年9月共收集标本25 422份，其中组织标本3 319份，外周血标本22 103份。肝脏肿瘤组织标本807例，其中肝脏恶性肿瘤762例，良性肿瘤23例，相关肝硬化22例。术前、术中、术后共收集血清9 240份，血浆9 178份；血液白细胞3 685份。所收集对象年龄为7～80岁，平均47.4岁；男性522例，约占64.7%；女性285例，约占35.3%。

2.2标本DNA提取及鉴定

从现有的组织样本库中随机抽取保存期为1年的液氮样本1例（癌和癌旁），依据TAKARA公司DNA提取试剂盒说明书提取样本组织DNA，提取后经1%琼脂糖凝胶150 V电压下电泳15 min，紫外灯下显示所检测的DNA完整性良好，可满足后续实验要求（图1）。

图1　随机抽取组织样本DNA电泳图

2.3标本RNA提取和鉴定

从现有的组织样本库中随机抽取保存期为1年的液氮样本5例（癌和癌旁），经Ambion mirVana miRNA Isolation Kit提取并纯化冻存组织RNA，经紫外分光光度计分析A260/A280≥1.8，对总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，发现标本的完整性较好，抽取样本RNA均可见清晰的28 S及18 S条带，结果表明，组织样本保存1年后，提示样本RNA质量完好，可满足后续实验研究（图2）。

3 讨论

全球每年肝癌新发超过50万，中国占50%以上，每年死于肝癌的人数达到11万，且其发病率和死亡率有逐年上升趋势。肝癌早期诊断率只有30%，确诊时多数患者已进入中晚期，患者发病五年后生存率仅为2%～10%，平均生存期4～6个月[1]。随着对肝脏肿瘤研究的深入，相关研究机构对肝脏肿瘤标本的需求日益增长。既往研究机构、研究人员仅限于针对某一课题的需要，进行有目的的肿瘤标本的收集，造成了临床标本资源的极大浪费，给深入研究肿瘤的生物学特征造成了很多不便，为此，建立肿瘤标本库成为现代肿瘤学研究的迫切任务。中国区肝癌的特点：90%以上合并病毒性肝炎（HBV阳性），85%合并肝硬化，丙肝肝癌发病率呈上升趋势[12]，肝癌在其发生、发展过程中影响因素错综复杂。解放军302医院作为全军最大的传染病肝病专科医院，技术力量雄厚，肝脏肿瘤标本来源充足。本样本库由专人负责，技术娴熟，经过两年时间的努力，目前我们生物样本库库存肿瘤组织3 319份，外周血标本22 103份。同时，定期每3个月对组织标本、血液（血清、血浆和白细胞）标本进行检测，发现标本保存质量良好，安全符合后续实验要求。此外，我们应用美国RURO公司FreezerPro冷冻样品智能信息系统用于肝癌组织库的管理，每例手术患者均有相对应的完整的储存于数据库中的病历资料和随访记录及精确位置。

肝脏肿瘤尤其是肝癌的研究是目前肝病领域的研究热点及难点，大多数均为个别研究，而系统深入的研究则需建立一个标准的标本资源库，这样既能保证研究的同质性、又能最大程度地利用有限的肝癌标本资源。肿瘤组织样本质量控制体系的规范化建立是标本库的关键，更是为科研实验提供的合格实验材料[13]。本中心标本库经过两年的运作及经验总结，质量控制体系应着重注意以下几点：（1）标本的收集及使用管理：标本收集工作由经过培训的专人负责，严格依据标本收集规范进行，组织离体时间不超过20 min，取材后应迅速放置于液氮中保存，尽可能避免标本内DNA、RNA及蛋白的降解，标本采集部位应严格按照要求进行[14]；标本出库使用后，应及时对相关实验结果进行反馈总结。（2）标本库的日常维护：制定严格的标本库管理的规章制度及相关操作规范，加强相关人员的培训及管理；定期检测标本库的液氮保存装置及低温冰箱，保证温控设备及监控报警设备完好，避免应设备故障发生标本反复冻融[15]。及时跟踪患者随访复查，收集术后标本及相关临床资料，建立和完善临床数据库。（3）标本库随机抽样检测：定期随机抽取组织样本，检测样本中DNA、RNA的完整性，明确样本是否发生降解，保证标本库中保存的组织样本符合生物样本保存质量标准要求，同时满足后续科研实验需要[16]。

综上所述，本中心具备成功建立和合理使用肝脏肿瘤样本库的软硬件条件，有能力建成高质量的肝脏肿瘤生物标本库。此外，在现有基础上，本中心还将继续从以下方面扩大、丰富肝脏肿瘤生物样本库：收集家族性共患肝脏肿瘤患者标本便于研究遗传因素在肿瘤发生发展中的作用；收集罕见肝脏肿瘤病例，便于深入研究罕见肝脏肿瘤发病机制，以求探索新的临床诊断和治疗策略。

参考文献：

[1]赫捷,赵平,陈万青.2012中国肿瘤登记年报[M].北京:军事医学科学出版社,2012,100 -101.

[2]HAJARIZADEH B,GREBELY J,DORE G J.Epidemiology and natural history of hcv infection[J].Nature reviews.Gastroenterology & hepatology,2013,10(9):553-562.

[3]MAXMEN A.Rna:The genome’s rising stars[J].Nature,2013,496(7443):127-129.

[4]YAZICI O,SENDUR M A,AKSOY S.Hepatitis c virus reactivation in cancer patients in the era of targeted therapies[J].World J Gastroenterol,2014,20(22):6716-6724.

[5]KHAN A G,WHIDBY J,MILLER M T,et al.Structure of the core ectodomain of the hepatitis c virus envelope glycoprotein 2[J].Nature,2014,509(7500):381-384.

[6]ARZUMANYAN A,REIS H M,FEITELSON M A.Pathogenic mechanisms in hbv- and hcv-associated hepatocellular carcinoma[J].Nature reviews.Cancer,2013,13(2):123-135.

[7]焦旭东,陈方满,汪国祥,等.消化道肿瘤肝转移的DSA表现及其临床意义[J].实用医学影像杂志,2008,9(3):154 -156.

[8]YUAN J H,YANG F,WANG F,et al.A long noncoding rna activated by tgf-beta promotes the invasion-metastasis cascade in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Cell,2014,25(5):666-681.

[9]MAHALE P,KASEB A O,HASSAN M M,et al.Hepatocellular carcinoma as a second primary cancer in patients with chronic hepatitis c virus infection[J].Digest Liver Dis,2015,47(4):348-349.

[11]QUARTEY B.Primary hepatic neuroendocrine tumor:what do we know now?[J].World J Oncol,2011,2(5):209-216.

[12]DE LOPE C R,TREMOSINI S,FORNER A,et al.Management of hcc[J].J Hepatol,2012,56:S75-S87.

[13]BRUIX J,SHERMAN M.Management of hepatocellular carcinoma:An update[J].Hepatology,2011,53(3):1020-1022.

[14]葛莲英,杨春,贺海平,等.肿瘤组织标本库的创建和管理方法探索[J].现代肿瘤医学,2010,18(11):2097 -2099.

[15]贺明,杨春,葛莲英,等.肿瘤标本库管理系统的建立与应用[J].中国数字医学,2010,05(6):63-64.

[16]王乐天,张庆,郝昱文,等.建立科研型肝癌肝移植标本库质量控制体系的初步探讨[J].武警医学,2014,25(10):987 -990.

[17]胡颖,张连海,季加孚,等.标本资源库存储与标识规范探讨[J].北京大学学报,2012,44(3):495-496.

（本文编辑：鲁翠涛）

·论著 基础研究·

[通讯作者简介]张绍庚，主任医师，博士，E-mail：Zhangsg302@hotmail.com。

作者简介][第一严锦（1975-），女，陕西汉中人，主管技师。

[收稿日期]2015-09-15

[中图分类号]R735.7

[文献标识码]A

doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.02.007